生長(zhǎng)抑制因子5抑制肺癌細(xì)胞增殖作用的研究

張旭濤 孟瑾 張峰

1.第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，陜西西安710032；2.解放軍309醫(yī)院藥劑科，北京100091

生長(zhǎng)抑制因子5抑制肺癌細(xì)胞增殖作用的研究

張旭濤1孟瑾2張峰1

1.第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，陜西西安710032；2.解放軍309醫(yī)院藥劑科，北京100091

目的探討生長(zhǎng)抑制因子5（ING5）抑制肺癌細(xì)胞增殖的作用。方法采用慢病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染方法建立A549細(xì)胞ING5高表達(dá)細(xì)胞系A(chǔ)549-ING5-OE和A549細(xì)胞空質(zhì)粒對(duì)照細(xì)胞系A(chǔ)549-control。采用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察ING5過(guò)表達(dá)對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖能力的影響；采用皮下接種方法建立裸鼠皮下移植瘤模型，觀察ING5對(duì)裸鼠皮下成瘤能力及腫瘤體積大小的影響。結(jié)果本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了肺癌A549-ING5過(guò)表達(dá)細(xì)胞系，與A549-control比較，細(xì)胞系A(chǔ)549-ING5-OE中ING5表達(dá)顯著增高；增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ING5高表達(dá)顯著抑制了肺癌細(xì)胞的增殖能力；克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示細(xì)胞系A(chǔ)549-ING5-OE中ING5高表達(dá)的肺癌細(xì)胞克隆形成能力明顯低于A549-control肺癌細(xì)胞（P＜0.01）；裸鼠在體水平研究結(jié)果顯示ING5高表達(dá)可以抑制裸鼠皮下成瘤及移植瘤的生長(zhǎng)。結(jié)論ING5可以抑制肺癌細(xì)胞的增殖，為臨床治療肺癌提供新的治療靶點(diǎn)。

肺癌細(xì)胞；生長(zhǎng)抑制因子5；增殖；克隆形成；裸鼠成瘤

肺癌的發(fā)生是個(gè)涉及多基因改變的復(fù)雜過(guò)程，其中癌基因的激活和抑癌基因的失活是兩大關(guān)鍵要素。生長(zhǎng)抑制因子（inhibitor of growth，ING）作為候選抑癌基因家族在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起重要抑制作用［1］，目前已發(fā)現(xiàn)5個(gè)成員，包括ING1、ING2、ING3、ING4、ING5［2］。ING編碼的蛋白在結(jié)構(gòu)上具有相似性，功能上存在共同的作用，ING蛋白參與磷脂酰肌醇介導(dǎo)的脂類信號(hào)通路及激素介導(dǎo)的通路，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和DNA損傷修復(fù)［3-7］，同時(shí)ING蛋白也具有各自的特點(diǎn)［8-13］。在多種腫瘤中ING家族基因的表達(dá)均下調(diào)［7］，已有的研究表明，在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中ING1、ING2、ING4均起到重要作用［14-15］。ING5作為家族的最新成員于2003年被首次報(bào)道。2006年Cote課題組［16］研究揭示ING5參與構(gòu)成兩種組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶（HAT）復(fù)合體，并且能與組蛋白結(jié)合而作為連接HAT與組蛋白的橋梁分子參與組蛋白修飾和染色質(zhì)重構(gòu)，表明ING5可通過(guò)輔助HAT表觀調(diào)控基因表達(dá)而發(fā)揮抑癌作用。ING5與臨床腫瘤發(fā)生的關(guān)系研究表明，61%的原發(fā)口腔腫瘤組織中ING5 mRNA水平降低，31例中有3例檢測(cè)到ING5基因發(fā)生突變；在肝癌組織中ING5 mRNA表達(dá)量下降，起到抑癌基因的作用［17］；在食管鱗癌組織中ING5 mRNA的表達(dá)量同樣下降［18］。進(jìn)一步研究表明ING5可與P53相互作用，并促進(jìn)P53轉(zhuǎn)錄活化，而引起結(jié)腸癌細(xì)胞周期阻滯和凋亡［19］。但I(xiàn)NG5在肺癌中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)擬建立ING5高表達(dá)肺癌細(xì)胞株，采用細(xì)胞增殖、克隆形成及裸鼠皮下荷瘤模型探討ING5對(duì)肺癌細(xì)胞的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

A549細(xì)胞（中科院上海細(xì)胞庫(kù)），GV218載體購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司，蛋白定量試劑盒、SDSPAGE凝膠配制試劑盒、細(xì)胞裂解液均購(gòu)自西安碧云天科技生物有限公司，蛋白酶抑制劑購(gòu)自瑞士Roche，G418購(gòu)自美國(guó)Gibco，細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM高糖、胎牛血清、胰蛋白酶消化液均購(gòu)自美國(guó)HyClone，青鏈霉素混合液購(gòu)自北京Solarbio，ING5抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自美國(guó)Advansta，兔二抗購(gòu)自英國(guó)Abcam，電子游標(biāo)卡尺購(gòu)自哈爾濱量具刃具有限責(zé)任公司，4%多聚甲醛購(gòu)自西安科昊生物技術(shù)有限公司，裸鼠由第四軍醫(yī)大學(xué)（以下簡(jiǎn)稱“我校”）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 GV218慢病毒載體轉(zhuǎn)染構(gòu)建A549-ING5-OE和A549-control細(xì)胞系

含ING5 cDNA的慢病毒載體和對(duì)照載體為吉?jiǎng)P公司構(gòu)建。用胰蛋白酶消化液消化293T細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為6×105個(gè)/mL，接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿，待細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前2 h將培養(yǎng)液換成無(wú)血清培養(yǎng)液，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入293T細(xì)胞培養(yǎng)液中，培養(yǎng)8 h后棄掉含有轉(zhuǎn)染復(fù)合物的培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞，加入10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)。48 h后收集293T細(xì)胞上清液，1000 r/min離心除去細(xì)胞碎片，收集上清即為病毒顆粒濃縮液。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞，培養(yǎng)液中加入病毒顆粒濃縮液進(jìn)行感染，12 h后觀察細(xì)胞狀態(tài)，沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒副作用，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后更換新的培養(yǎng)液，感染3 d后觀察GFP基因的的表達(dá)。感染后A549細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整密度為300個(gè)/孔，接種至6孔板，用G418篩選，藥物濃度為5 μg/mL，每隔24 h更換新的培養(yǎng)液，篩選3 d后，用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞克隆，挑取陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，直至獲得需要的細(xì)胞量。

1.3 Western blot檢測(cè)ING5在A549-control和A549-ING5-OE細(xì)胞中的表達(dá)

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549-control和A549-ING5-OE細(xì)胞在冰上裂解30 min，細(xì)胞裂解液為150 mmol/L NaCl、1%NP-40、0.5%去氧膽酸、0.1%SDS、50 mmol/L Tris（pH 8.0），蛋白酶抑制劑（1∶25），裂解后高速離心20 min，收集上清即為細(xì)胞總蛋白，蛋白定量試劑盒定量。SDS-PAGE凝膠配制試劑盒配制10%的凝膠。電泳，樣品在濃縮膠電壓100 V，20 min，在分離膠電壓120 V繼續(xù)電泳。轉(zhuǎn)膜，電壓55 V，210 min，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用麗春紅染液染色，PBST脫色。牛奶封閉1 h，一抗ING5（1∶1000）封閉4℃過(guò)夜。PBST洗3次，每次5 min，二抗封閉1 h，PBST洗3次，每次5 min。用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑盒（Amersham Bioscience）檢測(cè)蛋白的表達(dá)。

1.4 檢測(cè)ING5對(duì)肺癌細(xì)胞增殖的抑制

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549-control和A549-ING5-OE細(xì)胞用胰蛋白酶消化液消化，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104個(gè)/孔，接種至24孔板，兩種細(xì)胞各種4個(gè)復(fù)孔，每孔加1 mL 10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液。從細(xì)胞貼壁開(kāi)始計(jì)時(shí)24、48、72、96 h后各計(jì)數(shù)1次。

1.5 檢測(cè)ING5對(duì)肺癌細(xì)胞克隆形成能力的抑制

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549-control和A549-ING5-OE細(xì)胞用胰蛋白酶消化液消化，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為300個(gè)/孔，接種至6孔板，每孔加2 mL 10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液。細(xì)胞接種5 d后每孔各加500 μL胎牛血清繼續(xù)培養(yǎng)。貼壁生長(zhǎng)15 d后，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定15 min。固定后用0.1%結(jié)晶紫溶液染色15 min，PBS輕輕沖洗細(xì)胞，室溫風(fēng)干后計(jì)數(shù)多于50個(gè)細(xì)胞的克隆。根據(jù)公式計(jì)算克隆形成率：克隆形成率（%）=克隆數(shù)/300×100%。

1.6 ING5抑制裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)

出生4周雄性裸鼠，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各7只隨機(jī)分組，由第四軍醫(yī)大學(xué)（以下簡(jiǎn)稱“我校”）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心代養(yǎng)。裸鼠適應(yīng)7 d后，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549-control和A549-ING5-OE細(xì)胞用胰蛋白酶消化液消化，計(jì)數(shù)，調(diào)整密度為每只裸鼠5×106個(gè)/200 μL，混勻在無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液，分別接種至對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組裸鼠皮下。7 d后裸鼠皮下成瘤，每隔3 d用電子游標(biāo)卡尺測(cè)1次移植瘤長(zhǎng)徑（a）和短徑（b），并計(jì)算腫瘤體積（V）：ab2/2，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。裸鼠實(shí)驗(yàn)遵循我校關(guān)于動(dòng)物保護(hù)和做好動(dòng)物福利規(guī)定，并經(jīng)我校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Western blot檢測(cè)ING5蛋白表達(dá)

為了檢測(cè)ING5是否在所轉(zhuǎn)染細(xì)胞中高表達(dá)，將A549-control和ING5高表達(dá)細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)用細(xì)胞裂解液提取總蛋白，Western blot結(jié)果顯示與A549-control相比，ING5在A549-ING5-OE細(xì)胞中表達(dá)量顯著增高。見(jiàn)圖1。

圖1 ING5在A549-ING5-OE細(xì)胞中的表達(dá)情況

2.2 ING5抑制肺癌細(xì)胞增殖

顯微鏡下觀察可見(jiàn)A549-control和A549-ING5-OE細(xì)胞生長(zhǎng)良好，緊密排列，形態(tài)為梭形，細(xì)胞之間形成連接。A549-ING5-OE細(xì)胞的增殖速度明顯低于A549-control細(xì)胞，增殖速度為A549-control的一半，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)圖2。

圖2 A549-control與A549-ING5-OE細(xì)胞增殖曲線

2.3 ING5抑制肺癌細(xì)胞克隆形成能力

A549-control和A549-ING5-OE細(xì)胞接種在6孔板15 d后，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)多于50個(gè)的克隆，結(jié)果表明與A549-control相比ING5高表達(dá)肺癌細(xì)胞的克隆形成能力明顯降低，A549-ING5-OE細(xì)胞的克隆形成率為A549-control細(xì)胞的50%，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)圖3。

2.4 ING5抑制裸鼠皮下成瘤及移植瘤的生長(zhǎng)

裸鼠皮下接種A549-control和A549-ING5-OE細(xì)胞，7 d后成瘤，隨著時(shí)間的增加，接種A549-control裸鼠腫瘤生長(zhǎng)較快，接種A549-ING5-OE的裸鼠腫瘤生長(zhǎng)明顯較慢，結(jié)果表明ING5高表達(dá)后顯著抑制裸鼠皮下成瘤及移植瘤的生長(zhǎng)。見(jiàn)圖4。

圖3 A549-control與A549-ING5-OE克隆形成

圖4 生長(zhǎng)抑制因子5抑制裸鼠皮下種植瘤的生長(zhǎng)

2.5 接種A549-ING5-OE及A549-control細(xì)胞后大鼠體積變化情況

接種A549-ING5-OE細(xì)胞成瘤，腫瘤體積大小基本無(wú)增加。A549-control細(xì)胞接種成瘤，腫瘤體積明顯增大。從腫瘤生長(zhǎng)曲線可以看出ING5高表達(dá)的肺癌細(xì)胞腫瘤生長(zhǎng)明顯被抑制，腫瘤體積較對(duì)裸鼠A549-control細(xì)胞接種顯著減小。見(jiàn)圖5。

圖5 腫瘤生長(zhǎng)曲線

3 討論

作為候選抑癌基因家族成員，近年來(lái)ING家族在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用和機(jī)制受到越來(lái)越多的關(guān)注。路美玲等［17］研究結(jié)果表明，與正常肝組織相比，肝癌細(xì)胞株ING5 mRNA表達(dá)明顯降低，在腫瘤轉(zhuǎn)化過(guò)程中與正常組織相比ING5表達(dá)明顯被抑制。趙春陽(yáng)等［18］研究結(jié)果表明，在腫瘤細(xì)胞中ING5表達(dá)水平越低，腫瘤的惡性程度就越高。

研究表明，肺癌的發(fā)生、發(fā)展以及侵襲、轉(zhuǎn)移是多基因參與、多步驟發(fā)生的過(guò)程［19-20］。隨著近年來(lái)外科技術(shù)發(fā)展的日趨完善，新的化學(xué)治療藥物和局部治療方法不斷出現(xiàn)，但對(duì)肺癌的總體治療效果卻不甚理想，因此從分子水平研究肺癌發(fā)生、發(fā)展中的分子機(jī)制，針對(duì)肺癌中異常分子的治療藥物和治療方法就成了新的研究熱點(diǎn)，并促進(jìn)了肺癌分子靶向治療的出現(xiàn)。本研究中，通過(guò)慢病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染方法使ING5在A549細(xì)胞中高表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ING5高表達(dá)后與對(duì)照肺癌細(xì)胞相比，其增殖能力和克隆形成能力均降低，說(shuō)明在細(xì)胞水平ING5抑制了肺癌細(xì)胞的增殖和克隆形成能力。通過(guò)裸鼠在體水平的研究同樣發(fā)現(xiàn)，ING5抑制了裸鼠皮下成瘤及移植瘤的生長(zhǎng)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果同樣說(shuō)明ING5抑制了肺癌細(xì)胞的增殖，與上述細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

綜上所述，ING5在肺癌細(xì)胞高表達(dá)后抑制了肺癌細(xì)胞的增殖，提示ING5在肺癌的發(fā)生和發(fā)展中起到了抑癌基因的作用，為肺癌的基因治療提供了新的靶點(diǎn)。

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Study of the antiproliferative effects of inhibitor of growth 5 on lung cancer cells

ZHANG Xutao1MENG Jin2ZHANG Feng1
1.Department of Pharmacology,School of Pharmacy,the Fourth Military Medical University,Shaanxi Province,Xi'an 710032,China;2.Department of Pharmacy,the 309th Hospital of PLA,Beijing100091,China

ObjectiveTo study the antiproliferative effects of inhibitior of growth 5(ING5)on lung cancer A549 cells.MethodsING5 gene transfer was mediated by lentiviruses to establish ING5 over expression cell line A549-ING5-OE and the corresponding control cell line A549-control.Proliferation assay and colony formation assay were used to observe the effects of ING5 over-expression on the proliferation capacity of lung cancer cells.Mouse xenograft models were established with A549 ING5 over-expression cells and A549-control cells by subcutaneous injection.ResultsThe ING5 over-expression cell line A549-ING5-OE and A549-control cell line were established.ING5 over-expression inhibited proliferation and colony formation ability of A549 cells(P＜0.01).In vivo results showed ING5 over expression could suppress the ability of the tumorigenesis and tumor growth.ConclusionING5 over-expression can inhibit proliferation of lung cancer A549 cells,and provide a new therapeutic target for the clinical treatment of lung cancer.

Lung cancer cells;Inhibitor of growth 5;Proliferation;Colony formation;Nude mice xenografts

R734

A

1673-7210（2015）02（a）-0004-04

2014-11-14本文編輯：任念）

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（編號(hào)31071189）。

張旭濤（1989.5-），男，陜西渭南人，第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院2012級(jí)藥理學(xué)專業(yè)在讀碩士研究生；研究方向：分子藥理學(xué)。

張峰（1970.12-），女，博士，副教授；研究方向：分子藥理學(xué)。