食管鱗狀細(xì)胞癌組織中ADAMTS18基因的表達(dá)及臨床意義

郭麗麗 郭勝利 郭煒 董稚明 郭艷麗

[摘要] 目的 通過對食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC）組織中含凝血酶敏感素基序的去整合素金屬蛋白酶18（ADAMTS18）mRNA及蛋白表達(dá)情況的檢測，探討ADAMTS18在ESCC發(fā)生、發(fā)展中所起的作用及臨床意義，為ESCC的臨床早期診斷及預(yù)后評估提供新的客觀參考指標(biāo)。 方法 采用半定量-逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）的方法及免疫組化S-P的方法（生物素-鏈霉卵白素過氧化酶系統(tǒng)）對72例ESCC組織及癌旁正常組織中ADAMTS18 mRNA及蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測。 結(jié)果 ①ADAMTS18 mRNA在ESCC組織中的相對表達(dá)量為（0.361±0.115），在癌旁正常組織中表達(dá)量為（0.879±0.265），ESCC組織中ADAMTS18 mRNA表達(dá)量顯著低于癌旁正常組織（P < 0.01）；ADAMTS18 mRNA在高/中分化鱗癌組中的相對表達(dá)量為（0.496±0.153），在低分化鱗癌組中為（0.232±0.088），低分化鱗癌組ADAMTS18 mRNA表達(dá)量顯著低于高/中分化鱗癌組（P < 0.05）。②ADAMTS18蛋白在ESCC組織中的陽性表達(dá)率為34.7%（25/72），在癌旁組織中的陽性表達(dá)率為93.1%（67/72），ADAMTS18蛋白在ESCC組織中陽性表達(dá)率顯著低于癌旁組織（P < 0.01）；ADAMTS18蛋白在高/中分化鱗癌組中的陽性表達(dá)率為45.4%（20/44），在低分化鱗癌組中為17.8% （5/28），低分化鱗癌組ADAMTS18蛋白陽性表達(dá)率顯著低于高/中分化鱗癌組（P < 0.05）。 結(jié)論 ADAMTS18基因在ESCC中的異常表達(dá)與ESCC的發(fā)生、發(fā)展及組織分化程度關(guān)系密切，檢測ESCC組織中ADAMTS18基因的表達(dá)情況，有助于ESCC早期診斷及預(yù)后評估。

[關(guān)鍵詞] 食管鱗狀細(xì)胞癌；ADAMTS18；表達(dá)

[中圖分類號] R735.102 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）02（a）-0076-04

食管癌（esophageal carcinoma，EC）屬于上消化道常見的惡性腫瘤，全球每年新發(fā)食管癌人數(shù)約40萬例，死亡約30萬例，其中我國食管癌發(fā)病率和病死率在全球位居首位[1]。目前迫切需要對食管癌發(fā)病原因及機(jī)制進(jìn)行深入研究，從而尋求敏感、特異的早期診斷指標(biāo)和治療方法。含凝血酶敏感素基序的去整合素金屬蛋白酶（a disintegrin and metalloprotease with thrombospondin motifs，ADAMTS）家族的蛋白水解功能可能與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲有關(guān)。該家族不同成員在不同來源腫瘤的發(fā)生中所起的作用也不盡相同。國內(nèi)外對ADAMTS18基因的表達(dá)與食管癌的關(guān)系罕見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過對食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）組織及癌旁正常組織中ADAMTS18 mRNA及蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測，探討ADAMTS18與ESCC發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性及其生物學(xué)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源 組織標(biāo)本均來自河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院2008～2011年的ESCC手術(shù)患者，共72例，其中，男53例，女19例，年齡43～76歲，平均（61.2±2.5）歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會通過，入選患者均簽署了知情同意書。按照1997年國際抗癌聯(lián)盟（UICC）標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行TNM分期（Ⅰ期2例，Ⅱ期38例，Ⅲ期29例，Ⅳ期3例）；根據(jù)有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分為有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（45例）和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（27例）；按腫瘤組織分化程度分為高分化組（17例）、中分化組（27例）、低分化組（28例）。所有患者術(shù)前均未經(jīng)化療和放療，術(shù)中取癌旁正常黏膜組織以及ESCC原發(fā)灶組織。所有入選患者均通過胃鏡檢查診斷為食管癌，且術(shù)后病理檢查確診為ESCC，保存完整臨床病理資料及手術(shù)記錄。術(shù)中切取標(biāo)本時(shí)，遵循先取癌旁組織、后取腫瘤組織的原則，切除標(biāo)本一部分用于提取RNA，一部分用于制作蠟塊（HE染色及免疫組化染色）。

1.1.2 主要試劑 TRIzol（美國SBS公司）、總RNA提取試劑（美國Promega公司）、逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒（美國Foments 公司）、綠色體系（美國Promega 公司）、DNA Marker（北京Solarbio科學(xué)技術(shù)有限公司）、氯仿、異丙醇（上海化學(xué)試劑總廠）、瓊脂糖（西班牙進(jìn)口分裝）、DEPC（美國Invitrogen公司）、EB（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司）、兔抗人ADAMTS18多克隆抗體（生工生物工程有限公司）、免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)開發(fā)公司）、EDTA修復(fù)液（Gene Tech公司）、DAB顯色液（北京中杉金橋生物技術(shù)開發(fā)公司）。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR法檢測ADAMTS18 mRNA在ESCC組織中的表達(dá) 按照TRIzol試劑說明書低溫提取ESCC組織及癌旁組織中RNA，并參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。ADAMTS18上游引物為5'- TGCACAACGGCAGGAAAAAG-3'，下游引物為5'-TCAAAATCGCCGAGGGCTTA-3'；GAPDH作為內(nèi)參，上游引物為5'-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3'，下游引物為5'-GTGGTCGTTGAGGGCAAT-3'。RT-PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性10 min，94℃變性45 s，退火45 s，72℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)擴(kuò)增后，72℃ 7 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，ADAMTS18的PCR產(chǎn)物片段大小為114 bp，GAPDH為342 bp。采用Gel Pro Analysizer 3.1軟件測定ADAMTS18基因灰度值，每個(gè)細(xì)胞及組織標(biāo)本均重復(fù)做3次取平均值，以內(nèi)參照GAPDH的OD值標(biāo)化ADAMTS18基因的OD值，從而得到相對表達(dá)強(qiáng)度。

1.2.2 免疫組織化學(xué)S-P法（生物素-鏈霉卵白素過氧化酶系統(tǒng)）檢測ADAMTS18蛋白在ESCC組織中的表達(dá) 石蠟標(biāo)本常規(guī)4 μm連續(xù)切片，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色的切片經(jīng)脫蠟、水化后，采用3%甲醇過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶，EDTA緩沖液高壓鍋抗原熱修復(fù)。一抗為兔抗人ADAMTS18多克隆抗體，加SP試劑后DAB顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片。PBS代替一抗作為陰性對照，用已知平滑肌纖維組織陽性切片作為陽性對照。根據(jù)半定量標(biāo)準(zhǔn)：物鏡下陽性細(xì)胞≤10%判為1分；>10%～50%判為2分；>50%～75%判為3分；>75%判為4分。染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)判斷標(biāo)準(zhǔn)：無色判為0分；淡黃色判為1分；棕黃色判為2分；棕褐色判為3分。將上述兩項(xiàng)得分相加：0分表示為“-”，1～2分表示為“+”，3～4分表示為“++”，5～6分表示為“+++”。以“++”或“+++”時(shí)定義為陽性表達(dá)，以“-”或“+”時(shí)定義為陰性表達(dá)。免疫組化染色結(jié)果經(jīng)兩名有經(jīng)驗(yàn)的病理學(xué)醫(yī)師采用雙盲法診斷，一張切片需觀察至少5個(gè)高倍視野。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ESCC組織中ADAMTS18 mRNA的表達(dá)

ADAMTS18 mRNA在ESCC組織中的相對表達(dá)量為（0.361±0.115），在癌旁正常組織中為（0.879±0.265），ESCC組織中ADAMTS18 mRNA的表達(dá)量顯著低于相應(yīng)癌旁正常組織，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析兩者差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），見圖1。分組分析發(fā)現(xiàn)，低分化鱗癌組ADAMTS18 mRNA表達(dá)量顯著低于高/中分化鱗癌組，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；ADAMTS18 mRNA的表達(dá)與ESCC患者的年齡、性別、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期均無關(guān)（P > 0.05）。見表1。

1～3：癌旁正常組織；4～6： ESCC組織；7：DNA Marker；ESCC：食管鱗狀細(xì)胞癌

圖1 食管鱗狀細(xì)胞癌組織及癌旁正常組織中

ADAMTS18 mRNA表達(dá)

表1 食管鱗狀細(xì)胞癌患者臨床病理特征與ADAMTS18 mRNA表達(dá)的關(guān)系（x±s）

2.2 ESCC組織中ADAMTS18蛋白的表達(dá)

ADAMTS18蛋白的陽性產(chǎn)物主要位于細(xì)胞質(zhì)，染色均勻呈棕黃色（圖2，見封四）。72例癌旁組織中ADA MTS18蛋白陽性表達(dá)67例，陽性表達(dá)率為93.1%（67/72），72例ESCC組織中ADAMTS18蛋白陽性表達(dá)25例，陽性表達(dá)率為34.7%（25/72），ADAMTS18蛋白在ESCC組織中的表達(dá)陽性率顯著低于癌旁組織，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析兩者差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。分組分析發(fā)現(xiàn)，低分化鱗癌組ADAMTS18蛋白表達(dá)陽性率顯著低于高/中分化鱗癌組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；ADAMTS18蛋白表達(dá)與ESCC患者的年齡、性別、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期均無關(guān)（P > 0.05）。見表2。

表2 食管鱗狀細(xì)胞癌患者臨床病理特征與ADAMTS18蛋白表達(dá)的關(guān)系[n（%）]

3 討論

食管癌是常見的上消化道惡性腫瘤，全球統(tǒng)計(jì)其發(fā)病率位居惡性腫瘤發(fā)病率的第8位，病死率在惡性腫瘤病死率排名中位居第4位[1]。在世界范圍內(nèi)中國是食管癌發(fā)病率及病死率最高的國家。中國人群食管癌以ESCC為高發(fā)類型，占90%以上，以40歲以上男性較多見。自20世紀(jì)中葉至今，我國在ESCC手術(shù)切除率和患者5年生存率等諸多方面取得了矚目的成就，但ESCC患者中50%已經(jīng)發(fā)生了局部浸潤或者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，術(shù)后2年約半數(shù)患者仍然死于轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)，其預(yù)后差，遠(yuǎn)期生存率極低，晚期ESCC的5年生存率約為15%[2]，早期ESCC的5年生存率高于90%[3]。因此，ESCC患者重在疾病的早期診斷，對參與ESCC發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移過程中較特異的腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行研究，能夠?yàn)镋SCC的早期診斷提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，有效降低ESCC的病死率。

腫瘤相關(guān)基因發(fā)生突變或表達(dá)異常，致使機(jī)體發(fā)生惡性腫瘤，且能夠從原發(fā)腫瘤部位脫離并穿透基底膜，進(jìn)一步侵襲結(jié)締組織，使惡性腫瘤轉(zhuǎn)移至鄰近組織或者遠(yuǎn)處器官，這一系列復(fù)雜過程需要借助細(xì)胞-細(xì)胞/細(xì)胞-細(xì)胞間質(zhì)間的相互作用才能完成。腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力取決于其誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白酶降解細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）和基底膜能力的大小，ECM和基底膜表面存在多種受體，與腫瘤細(xì)胞結(jié)合后，腫瘤細(xì)胞通過誘導(dǎo)宿主基質(zhì)細(xì)胞大量分泌金屬蛋白酶類，并協(xié)同為腫瘤細(xì)胞浸潤、轉(zhuǎn)移創(chuàng)造有利的腫瘤微環(huán)境。其中，ADAMTS家族在腫瘤發(fā)生、浸潤、轉(zhuǎn)移過程中起著至關(guān)重要的作用。ADAMTS也稱Ⅰ型血小板結(jié)合蛋白基序的去整合素金屬蛋白酶，屬于Zn2+依賴-分泌型金屬蛋白酶超家族，包含19個(gè)基因家族成員，由平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌，屬于可溶性分泌蛋白酶，其中金屬蛋白酶域以及Ⅰ型凝血酶敏感蛋白（thrombospondin type Ⅰ，TSP1）基序?yàn)槠錁?biāo)志性結(jié)構(gòu)，TSP1基序能夠介導(dǎo)ADAMTS結(jié)合ECM蛋白并與之發(fā)生作用[4]。據(jù)報(bào)道，ADAMTS家族成員在正常的胚胎生長發(fā)育、性腺發(fā)育、卵巢正常生理過程、炎癥發(fā)生以及結(jié)締組織病、血栓性血小板減少性紫癜、血栓形成、惡性腫瘤等人體正常或異常的生理活動(dòng)中都扮演著重要的角色[5-10]。

ADAMTS18屬于全基因組關(guān)聯(lián)基因，位于人類染色體16q23，含有13個(gè)外顯子，可以編碼一個(gè)含有1222個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)[11]。關(guān)于ADAMTS18與ESCC的關(guān)系國內(nèi)外尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR及免疫組化技術(shù)檢測了72例ESCC黏膜組織及其相應(yīng)癌旁正常黏膜組織中的ADAMTS18 mRNA及蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ESCC組織中ADAMTS18 mRNA的表達(dá)量及ADAMTS18蛋白的陽性表達(dá)率均顯著低于癌旁正常黏膜組織。推測ADAMTS18在ESCC組織中屬于抑癌基因，它的異常表達(dá)導(dǎo)致ESCC的發(fā)生，目前國外文獻(xiàn)[11-12]也有結(jié)果一致的報(bào)道，但對于ADAMTS18是如何發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞生長作用的機(jī)制還不甚明確。ADAMTS18可能直接作用于其他抑制因子，從而起到間接抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用；也可能通過裂解血小板聚合物實(shí)現(xiàn)，血小板裂解產(chǎn)物能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生血管反應(yīng)，逐漸使癌變組織細(xì)胞修復(fù)至正常組織細(xì)胞狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)患者的臨床病理特征進(jìn)行分組分析，ADAMTS18 mRNA及蛋白的表達(dá)可能與組織分化程度關(guān)系緊密，高/中分化ESCC組ADAMTS18 mRNA相對表達(dá)量以及ADAMTS18蛋白陽性表達(dá)率均明顯高于低分化ESCC組，隨著ESCC組織分化程度逐漸下降，ADAMTS18基因的表達(dá)也隨之下調(diào)。有文獻(xiàn)證實(shí)，人類黑素瘤中存在著ADAMTS18基因的大規(guī)模突變及異常表達(dá)，體外實(shí)驗(yàn)中ADAMTS18的基因突變能夠降低層粘連蛋白的黏附作用，從而促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[13]。本研究證實(shí)，ADAMTS18基因的低水平表達(dá)可能會促進(jìn)ESCC的發(fā)生發(fā)展，其高水平表達(dá)可能會抑制ESCC的發(fā)生發(fā)展，屬于抑癌基因。

腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移已成為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)之一。ADAMTS家族成員廣泛參與機(jī)體多種重要的生理性以及病理性活動(dòng)過程，例如細(xì)胞凋亡、血管新生、腫瘤發(fā)生發(fā)展等，因此對ADAMTS結(jié)構(gòu)、功能以及其與人類多種疾病關(guān)系的深入研究，能夠?yàn)榧膊〉脑缙谠\斷、后續(xù)治療、預(yù)后評估提供堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)和廣闊的前景。關(guān)于ADAMTS18在ESCC組織中的異常表達(dá)對腫瘤發(fā)生發(fā)展影響的確切機(jī)制還有待進(jìn)一步研究探討。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Parkin DM，Bray F，F(xiàn)erlay J，et al. Global cancer statistics，2002 [J]. CA Cancer J Clin，2005，55（2）：74-108.

[2] Jemal A，Murray T，Ward E，et al. Cancer statistics，2005 [J]. CA Cancer J Clin，2005，55（1）：10-30.

[3] Headrick JR，Nichols FC，Miller DL，et al. High-grade esophageal dysplasia：long-term survival and quality of life after esophagectomy [J]. Ann Thorac Surg，2002，73（6）：1697-1703.

[4] Porter S，Clark IM，Kevorkian L，et al. The ADAMTS metalloproteinases [J]. Biochem J，2005，386（Pt 1）：15-27.

[5] Robker RL，Russell DL，Espey LL，et al. Progesterone-regulated genes in the ovulation process：ADAMTS-1 and cathepsin L proteases [J]. Proc Natl Acad Sci USA，2000，97（9）：4689-4694.

[6] Mittaz L，Russell DL，Wilson T，et al. Adamts-1 is essential for the development and function of the urogenital system [J]. Biol Reprod，2004，70（4）：1096-1105.

[7] Blelloch R，Kimble J. Control of organ shape by a secreted metalloprotease in the nematode Caenorhabditis elegans [J]. Nature，1999，399（6736）：586-590.

[8] Nagase H，Kashiwagi M. Aggrecanases and cartilage matrix degradation [J]. Arthritis Res Ther，2003，5（2）：94-103.

[9] Tsai HM. Deficiency of ADAMTSl3 in thrombotic thrombocytopenic purpura [J]. Int J Hematol，2002，76（Suppl 2）：132-138.

[10] Porter S，Scott SD，Sassoon EM，et al. Dysregulated expression of adamalysin-thrombospondin genes in human breast carcinoma [J]. Clin Cancer Res，2004，10（7）：2429-2440.

[11] Jin H，Wang X，Ying J，et al. Epigenetic identification of ADAMTS18 as a novel 16q23.1 tumor suppressor frequently silenced in esophageal，nasopharyngeal and multiple other carcinomas [J]. Oncogene，2007，26（53）：7490-7498.

[12] Li Z，Zhang W，Shao Y，et al. High-resolution melting analysis of ADAMTS18 methylation levels in gastric，colorectal and pancreatic cancers [J]. Med Oncol，2010，27（3）：998-10004.

[13] Wei X，Prickett TD，Viloria CG，et al. Mutational and functional analysis reveals ADAMTS18 metalloproteinase as a novel driver in melanoma [J]. Mol Cancer Res，2010，8（11）：1513-1525.

（收稿日期：2014-10-15 本文編輯：程 銘）