金雀異黃素對雌激素依賴靶基因轉錄的調節作用

孫瑩 孫肅 孫靜

1.遼寧省腫瘤研究所，遼寧沈陽110042；2.遼寧省職業病防治院，遼寧沈陽110005

金雀異黃素對雌激素依賴靶基因轉錄的調節作用

孫瑩1孫肅2孫靜1

1.遼寧省腫瘤研究所，遼寧沈陽110042；2.遼寧省職業病防治院，遼寧沈陽110005

目的觀察金雀異黃素（genistein，GNT）對雌激素受體（estrogen receptor，ER）靶基因的轉錄調節作用。方法采用不同濃度的金雀異黃素（5、10、20 ng/mL）+雌二醇（10 ng/mL）或雌二醇單獨處理乳腺癌細胞MCF7，36 h后收集細胞檢測金雀異黃素對雌激素反應元件（estrogen response element，ERE）報告基因的轉錄調控作用，通過定量PCR技術檢測金雀異黃素對ER靶基因PDZK1和GREB1轉錄水平的影響。結果隨著金雀異黃素濃度的增高，ER報告基因的轉錄水平逐漸下降，與之相一致，PDZK1和GREB1的轉錄水平也逐漸下降，組間差異有統計學意義（P＜0.05）。結論金雀異黃素能夠與雌二醇競爭結合細胞表面的ER，并拮抗ER調控的靶基因表達。

金雀異黃素；雌二醇；雌激素受體；轉錄調控

植物中有各種抗炎抗腫瘤作用的活性物質［1］，大豆異黃酮是已知的植物雌激素，在預防和治療腫瘤、心血管疾病、骨質疏松癥和絕經后綜合征等方面的作用已經得到廣泛認可［2］。金雀異黃素化學名為4，5，7-三經基異黃酮，性狀是淡黃色樹枝狀針晶粉末，熔點（mp）297～298℃，溶于常用的有機溶劑，幾乎不溶于水，溶于稀堿中呈黃色。金雀異黃素（又稱染料木素）是來源于豆類植物和齒狀植物的異黃酮類化合物，可通過影響一系列的細胞信號通路，發揮廣泛的預防和治療腫瘤作用［3-5］。金雀異黃素是一種強力的酪氨酸蛋白激酶和拓撲異構酶抑制劑，通過抑制以上兩種酶的活性，達到對癌基因的調控，從而實現多途徑抑制腫瘤的生長轉移［6］。金雀異黃素（Genistein）增加性激素結合球蛋白合成，從而降低激素生物利用度，降低雌激素依賴細胞增殖活性，減少激素相關腫瘤的發生。但金雀異黃素水溶性很低，直接服用不利于人體吸收［7］，能否降低雌激素的生物利用度，抑制雌激素調控的靶基因表達目前還不明確。金雀異黃素抗癌研究已經成為全球熱點，并已取得很大進展［8］。本文通過報道基因及實時定量PCR實驗證實金雀異黃素能夠和雌二醇競爭乳腺癌細胞表面的雌激素受體（ER），并抑制ER調控靶基因的表達，現將結果報道如下：

1 材料與方法

1.1 材料

乳腺癌細胞系MCF7購自北京協和細胞庫。雌二醇（純度99%）購自北京四環制藥廠；金雀異黃素（純度98%）購自Sigma公司；DMEM培養基及Real Mastermix（SYBR Green）購自天根公司；反轉錄試劑盒購自Invitrogen公司；Fugene 6轉染試劑為Roche Diagnostics公司產品；雙報告基因熒光素酶檢測試劑盒為Promega公司產品。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組實驗分為五組：單純DMEM培養基不加藥組；雌二醇組（10 ng/mL）；金雀異黃素5 ng/mL+雌二醇組；金雀異黃素10 ng/mL+雌二醇組；金雀異黃素20 ng/mL+雌二醇組。

1.2.2 報告基因檢測將乳腺癌細胞MCF7接種于24孔板，按“1.2.1”項下分組條件處理細胞，培養至對數生長期后，按照Fugene 6轉染試劑說明將2.0 μg報告基因質粒pTAL-SEAP-ERE和校正質粒pSV-β-gal（10 ng）轉染至乳腺癌細胞MCF7細胞中，繼續培養36 h，收集細胞按照雙報告基因檢測試劑盒說明檢測熒光素酶活性，每組3個復孔，每次數據重復3次。

1.2.3 Real-time PCR將乳腺癌細胞MCF7細胞接種到6孔板中，按“1.2.1”項下分組條件處理細胞，48 h后收集細胞加入1 mL Trizol，按照Invitrogen反轉錄試劑盒說明反轉錄合成cDNA第一鏈。采用LightCycler實時定量PCR系統（Roche公司產品）進行Real-time PCR。Real-time PCR引物按照文獻合成［9-10］。GREB1上游引物：5'-CAAAGAATAACCTGTTGGCCCTGC-3'，下游引物：5'-CCAGTTGT-TGGCACTTCGG-3'；PDZK1上游引物：5'-AGAAATGGCCTCCACCTTCAAC-3'，下游引物5＇-ACGGGCCCTCTAGACTCGAG-3'。GAPDH引物購自Takala公司。PDZK1和GREB1基因的擴增條件為：95°C預變性2 min；95°C變性10 s，60°C退火10 s，72°C延伸10 s，共45個循環；72°C延伸5 min。用GAPDH的定量值對待測基因的定量值進行均一化，進而得到待測基因的相對表達量。

1.3 統計學方法

應用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 金雀異黃素對ERE報告基因轉錄的抑制作用

加入雌二醇后，ERE報告基因的轉錄活性較不加藥組提高約5倍，提示乳腺癌細胞MCF7細胞表面有ER表達，乳腺癌細胞MCF7細胞能夠對雌激素產生應答；隨著金雀異黃素濃度的增高，ERE報告基因的轉錄活性逐漸下降，金雀異黃素20 ng/mL+雌二醇組和雌二醇組比較差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01），說明金雀異黃素能夠和雌二醇競爭乳腺癌細胞MCF7細胞表面的ER，并抑制雌二醇的轉錄激活效應。見表1。

表1 金雀異黃素對ERE報告基因的轉錄調控作用（x±s，n=3）

2.2 金雀異黃素對ER靶基因PDZK1和GREB1轉錄的抑制作用

為了確定金雀異黃素是否影響ER靶基因的轉錄，本研究采用Real-time PCR法檢測了ER靶基因PDZK1和GREB1 mRNA水平。結果顯示，隨著金雀異黃素濃度的增高，PDZK1和GREB1的轉錄水平逐漸下降，金雀異黃素20 ng/mL+雌二醇組和雌二醇組PDZK1和GREB1 mRNA水平差異均有高度統計學意義（P＜0.01），該結果和報告基因實驗結果一致，說明金雀異黃素可以拮抗雌激素調控的靶基因表達。見表2。

表2 金雀異黃素對ER靶基因PDZK1、GREB1的轉錄調控作用（x±s，n=3）

3 討論

金雀異黃素是來源于植物并有與雌激素相似結構的植物雌激素（phytocstrogen），其雌激素的調節作用引起廣泛關注。目前植物雌激素作為激素替代藥物、抗癌藥物以及食品添加物和補充物應用［11］。大豆異黃酮是大豆產生的天然植物雌激素，其化學結構和雌二醇非常相似，而生物學活性卻只有雌二醇的1/10萬。近年研究證實，異黃酮的抗腫瘤效應主要是通過兩種途徑完成的，一種是ER依賴性，一種是ER非依賴性。在ER依賴途徑中，異黃酮能夠和雌激素競爭細胞表面的ER，進而拮抗雌激素調控的靶基因轉錄。在ER非依賴途徑中，大豆異黃酮可以通過抑制酪氨酸蛋白激酶和拓撲異構酶發揮抗腫瘤作用。酪氨酸激酶及拓撲異構酶是細胞內重要的功能酶，很多參與細胞增殖及DNA損傷修復的功能蛋白均是它們的作用底物，抑制酪氨酸激酶和拓撲異構酶的活性，可以阻斷細胞的生長激動信號，造成DNA損傷，促使細胞走向凋亡［12-14］。

徐琳琳等［15］認為，腫瘤的發生發展是多因素、多階段的過程，其中既包括遺傳因素也涉及到非遺傳因素，如環境和飲食等。流行病學調查發現，攝入高含量的豆制品和綠茶可影響腫瘤及其他慢性疾病的發展［16］。金雀異黃素是大豆異黃酮的有效成分之一，已有研究資料表明，金雀異黃素是酪氨酸蛋白激酶和拓撲異構酶的強效抑制劑，金雀異黃素是否具有ER依賴性的抗腫瘤效應目前還不明確。雌激素在乳腺癌的起始和進展過程中充當重要角色，雌激素通過核受體超家族成員ER調節基因轉錄而控制生理和病理過程。ER是配體依賴型轉錄調節蛋白，它調控細胞生長和分化許多方面的基因程序［17］。在研究金雀異黃素與人類健康的關系時，從細胞分子水平、動物模型到人體實驗、大規模流行病學調查的結果存在較大的爭議，實驗室中金雀異黃素用量通常遠高于食物中的含量，且使用的種類、純度、用量，采用的細胞系以及其他實驗條件等均不盡相同，缺乏統一的評價標準，給金雀異黃素的研究工作和廣泛應用帶來一定的困難。隨著對金雀異黃素功能性和營養性的深入研究，其提取及精制工藝的不斷完善，金雀異黃素將會在醫藥、保健品、食品、飲料及其它行業得到越來越廣泛的應用［18］。本文以ER表達的乳腺癌細胞MCF7作為研究對象，用不同濃度的金雀異黃素和雌二醇共同處理乳腺癌細胞MCF7細胞，結果顯示，金雀異黃素可以拮抗雌二醇的激動效應，并且其競爭效應和金雀異黃素的濃度具有相關性。金雀異黃素20 ng/mL+雌二醇組與單純雌二醇組比較，PDZK1和GREB1基因的轉錄水平差異顯著。這個結果說明金雀異黃素和大豆異黃酮的其他組分一樣，具有ER依賴性及ER非依賴的雙重抑癌效應，本實驗為揭示金雀異黃素的作用機制提供了基礎資料。

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Regulating effcet of Genistein on target-gene transcription of estrogen dependent

SUN Ying1SUN Su2SUN Jing1
1.Liaoning Tumor Institute,Liaoning Province,Shenyang110042,China;2.Liaoning Occupational Disease Precaution Clinic,Liaoning Province,Shenyang110005,China

ObjectiveTo observe the transcription effect of genistein(GNT)on estrogen receptor(ER)target-gene.MethodsBreast cancer cells line MCF7 were treated with GNT of different concentration(5,10,20 ng/mL)+estradiol (10 ng/mL)or estradiol only.Then 36 hour later,cells were collected to detect the transcription effect of GNT on report gene of estrogen response element(ERE).Quantitative PCR was applied to evaluate the expression level of ER targetgene PDZK1 and GREB1 by GNT.ResultsThe transcription level of ER target-gene decreased gradually with the increasing of GNT concentration,and the expression level of PDZK1 and GREB1 reduced consistently with the ER transcription,the differences were statistical significance among different groups(P＜0.05).ConclusionGNT can depress expression of ER gene by competing ER of cell surface with estradiol.

Genistein;Estradiol;Estrogen receptor;Transcriptional control

R344+.13；R285.5

A

1673-7210（2015）02（a）-0012-03

2014-10-05本文編輯：程銘）

國家自然科學基金資助項目（編號81372287）。