健脾化痰方對胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞NF-κB、脂聯素和抵抗素的影響

李保良， 張 琪， 林冠凱， 費建平， 居凌云

（常州市中醫醫院脾胃病科，江蘇常州213003）

［科研報道］

健脾化痰方對胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞NF-κB、脂聯素和抵抗素的影響

李保良， 張 琪， 林冠凱， 費建平， 居凌云

（常州市中醫醫院脾胃病科，江蘇常州213003）

目的觀察健脾化痰方對胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞NF-κB表達和脂聯素、抵抗素分泌的影響，探討其改善胰島素抵抗 （IR）的機制。方法采用細胞培養技術，將3T3-L1小鼠前脂肪細胞誘導分化為成熟脂肪細胞，通過地塞米松誘導建立IR細胞模型，將脂肪細胞分為正常組 （基礎培養液加10%空白組血清培養正常脂肪細胞）、模型組（基礎培養液加10%空白組血清培養IR脂肪細胞）、健脾化痰組 （基礎培養液加10%健脾化痰組血清培養IR脂肪細胞）和吡格列酮組 （基礎培養液加10%吡格列酮組血清培養IR脂肪細胞），培養48 h，葡萄糖氧化酶法檢測細胞培養上清液中葡萄糖濃度，ELISA法檢測細胞培養上清液中脂聯素和抵抗素量，RT-qPCR檢測NF-κB表達。結果與正常組比較，模型組葡萄糖消耗量和脂聯素含有量顯著降低 （P＜0.05），抵抗素含有量顯著升高 （P＜0.05），NF-κB表達明顯上調 （P＜0.05）；與模型組比較，健脾化痰組和吡格列酮組葡萄糖消耗量和脂聯素含有量明顯升高 （P＜0.05），抵抗素含有量顯著降低 （P＜0.05），NF-κB表達下調 （P＜0.05）。結論NF-κB、脂聯素和抵抗素參與IR發生，健脾化痰方可能通過抑制IR脂肪細胞NF-κB異常表達，增加脂聯素分泌、減少抵抗素分泌，改善IR。

胰島素抵抗；健脾化痰方；NF-κB；脂聯素；抵抗素；3T3-L1脂肪細胞

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）已成為臨床常見的一種慢性肝病，其發生發展機制尚未完全清楚。近年來研究表明，胰島素抵抗 （insulin resistance，IR）在NAFLD發生發展中起關健作用，IR不僅導致脂肪在肝臟堆積，還引起肝細胞炎癥、壞死，形成非酒精性脂肪性肝炎甚至肝硬化［1-3］。越來越多的研究表明脂肪組織是IR產生的始發部位，其分泌的脂肪細胞因子如脂聯素、抵抗素、IL-6等與IR密切相關，針對脂肪細胞因子表達異常的治療方法可顯著改善IR［3-6］，因此，改善IR狀態脂肪細胞因子分泌成了目前防治IR相關的NAFLD等病的熱點。健脾化痰方是我院治療NAFLD的有效專方，多年來，在臨床應用中療效顯著，并有較好的護肝、調節血脂和抗氧化等作用［7-8］。本實驗運用藥物血清學研究方法，觀察健脾化痰方含藥血清對胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞NF-κB表達、脂聯素和抵抗素分泌的影響，探討健脾化痰方改善胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞IR的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物與細胞株 SPF級雄性Wistar大鼠，由南京中醫藥大學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK（蘇）2002-0031。3T3-L1小鼠前脂肪細胞株，購于浙江大學細胞研究室。

1.2 藥物 健脾化痰方 （炒黨參10 g、炒白術10 g、茯苓10 g、澤瀉15 g、橘絡12 g，姜半夏12 g、茵陳30 g、桂枝6 g、姜黃10 g、絞股藍20 g、炙甘草3 g）購自常州市中醫醫院中藥房，常規水煎，濃縮至1.20 g/mL，-20℃保存備用；鹽酸吡格列酮片 （江蘇德源藥業有限公司，批號41203274）。

1.3 試劑 1640培養基，胎牛血清 （FBS）和胰蛋白酶（GIBCO公司）；3-異丁基-1-甲基次黃嘌呤（IBMX）；地塞米松，牛胰島素，油紅O干粉 （Sigma公司）；葡萄糖測定試劑盒-氧化酶法 （北京普利萊基因技術有限公司）；脂聯素、抵抗素ELISA檢測試劑盒（Uscnk公司）；高純總RNA快速提取試劑盒（Generay公司）；逆轉錄試劑盒（Fermentas公司）；qPCR試劑盒（Bio-Rad公司）；其余試劑均為國產分析純。

1.4 儀器 3111型二氧化碳培養箱（Thermo公司）；spectra Plus 384型全波長酶標儀（美國MD公司）；ECLIPSE Ti-S型倒置熒光顯微鏡（Nikon公司）；SW-CF-2FD凈化工作臺 （蘇州凈化設備有限公司）；5810R型臺式高速冷凍離心機（Eppendorf公司）；80-2型臺式低速離心機（上海醫療器械 （集團）有限公司）；DHG-9070A恒溫箱 （上海精宏）；Merinton SMA4000高精度分光光度計，CFX connect Real-Time PCR System及配套分析軟件（Bio-Rad公司）。

1.5 含藥血清的制備 SPF雄性Wistar大鼠40只，體質量 （200±20）g，適應性喂養2 d后，隨機分組為空白組、健脾化痰組和吡格列酮組，根據人和動物間體表面積折算的等效劑量比值，換算不同的藥物灌胃劑量，然后取等效劑量10倍量灌胃，即健脾化痰方2.4 g/（kg·d），吡格列酮40.5 mg/（kg·d），空白組給予相同體積的生理鹽水灌胃，連續給藥5次，每日相同時間分別給藥2次，在第4次灌胃后禁食不禁水12 h后最后1次給藥，1 h后，10%水合氯醛腹腔麻醉，無菌條件下腹主動脈取血，分別制備成空白組血清、健脾化痰組血清和吡格列酮組血清，滅活、過濾除菌、分管，-70℃保存備用。

1.6 實驗步驟

1.6.1 3T3-L1小鼠前脂肪細胞培養及誘導分化成脂肪細胞

在37℃、5%CO2的條件下，3T3-L1前脂肪細胞置于含10%FBS的1640培養基的6孔培養板中培養，待細胞融合2 d后，換用含0.5 mmol/L IBMX、1μmol/L地塞米松、5μg/mL胰島素和10%FBS的1640培養，48 h后再換用含5μg/mL胰島素和10%FBS的1640培養基培養48 h，隨后以10%FBS的1640培養基繼續培養，2 d換液一次，誘導分化8～12 d的3T3-L1前脂肪細胞90%～95%呈脂肪細胞表型，進行油紅O染色鑒定為脂肪細胞，可用于實驗。

1.6.2 建立胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞模型 參照文獻［9-10］，采用地塞米松誘導建立胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞模型，對分化好的脂肪細胞分為正常組和模型組，正常組用10%FBS的1640培養基，模型組用含有1μmol/L地塞米松、10 nmol/L胰島素和10%FBS的1640培養基，共培養144 h。每48 h換液，取培養上清液，用葡萄糖氧化法檢測其葡萄糖量，計算葡萄糖消耗量，二者間差異有統計學意義作為建模成功依據。

1.6.3 分組及處理 正常脂肪細胞為正常組，胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞模型隨機分為模型組、健脾化痰組和吡格列酮組。正常組和模型組均給予含空白組血清的培養基，健脾化痰組和吡格列酮組分別給予含健脾化痰組血清和吡格列酮組血清的培養基，血清濃度均為10%，37℃、5% CO2培養48 h后，收集細胞上清，用于檢測脂聯素和抵抗素量，同時收集各組細胞，提取細胞總RNA，以測定細胞NF-κB表達。1.6.4 葡萄糖消耗量測定 取細胞培養上清液，2 000×g離心10min，收集上清，以葡萄糖氧化酶法檢測每孔培養液中葡萄糖的量，與未接種細胞的空白孔葡萄糖量相減，計算葡萄糖消耗量。

1.6.5 ELISA法測定上清液中脂聯素和抵抗素 取細胞培養上清液，2 000×g離心10 min，收集上清，按照ELISA試劑盒說明書操作檢測脂聯素和抵抗素。

1.6.6 實時熒光定量PCR技術測定脂肪細胞NF-κB基因mRNA水平

1.6.6.1 總RNA的提取及鑒定 每10 cm2生長的培養細胞中加入1 mL Trizol試劑，按說明書提取總RNA，測定RNA的純度和質量，滿足RT-qPCR要求。

1.6.6.2 引物合成 參考16sRND基因文庫設計引物。NF-κB引物序列，正向5＇-TCA ATGGCTACACAGGACCA-3＇，反向5＇-ATCTTGAGCTCCGCAGTGTT-3＇；β-actin引物序列，正向5＇-CAAAAGCCACCCCCACT CCTAAGA-3＇，反向5＇-GCCC TGGCTGCCTCAACACCTC-3＇。以上引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.6.6.3 逆轉錄反應 按下列順序將試劑加入到EP管中（共12μL）并進行操作：總RNA 3μL（約1μg），Oligo（dT）18引物1μL，隨機引物1μL，DEPC水7μL，混勻，短暫離心，65℃干浴5 min；在冰上冷卻，短暫離心，再放回冰上；往EP管里面加入以下試劑（共8μL）：5 x Reaction Buffer4μL，Ribolock TMRNase Inhibition（20 U/μL）1 μL，10 mmol/L dNTP（mix）2μL，RevertAid TMM-MmLv Reverse Transcriptase 1μL，至總體積20μL；混勻，25℃干浴5 min，接著42℃干浴60 min。70℃干浴5 min終止反應。-70℃保存cDNA。

1.6.6.4 熒光定量PCR擴增實驗 PCR擴增反應體系：IQ SYBR Green Supermix 12.5μL，正向引物10μmol/L 1 μL，反向引物10μmol/L 1μL，cDNA10.5μL。qPCR實驗參數：①50.0℃預熱3 min，②95.0℃預變性3 Min，③95.0℃變性10 sec，④60.0℃退火20 sec，⑤72.0℃延伸30 sec（終點讀板模式），⑥從③至⑤重復40次，⑦每10 sec增加0.5℃，在65℃至95℃溫度范圍內建立熔解曲線 （終點讀板模式），⑧結束。實驗結果由熒光定量PCR分析軟件BIO-RAD CFX Manager自動進行統計和計算，生成相應的數據文件。

1.7 統計分析方法 采用SPSS 13.0統計軟件進行統計分析，計量資料數據以均數±標準差 （x±s）表示，組間及自身前后比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 3T3-L1前脂肪細胞誘導分化及鑒定 誘導分化前的3T3-L1脂肪細胞呈梭形，與成纖維細胞相似，胞漿中無脂滴；定向分化為成熟的脂肪細胞典型表現為細胞漿豐富，含有大量脂肪滴，脂滴分布在核周圍，呈 “戒環樣”結構，油紅O染色后可見胞質中脂滴著紅色 （見圖1）。

2.2 正常組和模型組各時點葡萄糖消耗量 由表1可知，用地塞米松誘導培養3T3-L1脂肪細胞48、96、144 h后，模型組葡萄糖消耗量均顯著降低，與正常組比較，差異有統計學意義 （P＜0.05），提示分化成熟的3T3-L1脂肪細胞經地塞米松誘導48 h建立IR脂肪細胞模型成功，并在144 h內較穩定。

表1 各時點葡萄糖消耗量比較 （x±s）

圖1 3T3-L1脂肪細胞鑒定（×100）

2.3 健脾化痰方對IR脂肪細胞葡萄糖消耗量、脂聯素和抵抗素分泌的影響 由表2可知，培養48 h時，模型組葡萄糖消耗量明顯低于其他3組，健脾化痰組和吡格列酮組低于正常組，健脾化痰組低于吡格列酮組，差異均有統計學意義（P＜0.05），提示健脾化痰方和吡格列酮均可顯著提高IR脂肪細胞葡萄糖消耗量，吡格列酮優于健脾化痰方；模型組上清中脂聯素量明顯低于其他3組，健脾化痰組和吡格列酮組又顯著低于正常組，吡格列酮組低于健脾化痰組，差異均有統計學意義 （P＜0.05）；模型組上清中抵抗素量高于其他3組，差異有統計學意義 （P＜0.05），提示IR時，健脾化痰方可增加脂聯素分泌和抑制抵抗素分泌。

2.4 各組細胞提取總RNA的質量和純度 由表3可知，各組細胞所提取的RNA的A260/A280＞2.0且＜2.3，提示制備的RNA較純，由圖2可知，各組樣品RNA均有清晰的5S、28S和18S三條帶，且28S/18S約為2/1，提示樣品RNA完整性好，RNA的質量濃度＞3.2μg/μL，總量＞50 μg。說明各樣品總RNA的質量、濃度和總量符合進行RT-qPCR實驗要求。

表2 4組上清葡萄糖消耗量、脂聯素和抵抗素比較（x±s）

表3 各組細胞總RNA的質量（x±s）

圖2 總RNA電泳圖

2.5 各組細胞NF-κB基因mRNA表達 由表4可知，當脂肪細胞出現胰島素抵抗時，與正常脂肪細胞相比，NF-κB基因表達水平顯著升高 （P＜0.05），健脾化痰組和吡格列酮組均能顯著下調其表達 （P＜0.05）。

3 討論

隨著社會發展，與IR相關的疾病，如2型糖尿病、NAFLD和肥胖等，發病率呈上升趨勢，有關IR產生機制和治療措施是近年的研究熱點，胰島素作用的主要靶器官脂肪組織不僅是脂質能量貯存庫，而且還可以分泌多種細胞因子參與機體物質代謝，調節能量平衡等，如分泌脂聯素、抵抗素、瘦素、TNF-α、IL-6等，在參與維持機體組織對胰島素敏感性中具有重要作用［11］。

表4各組脂肪細胞NF-κB基因MRNA表達水平比較（x±s）

脂聯素主要由脂肪細胞分泌，具有多種生物效能，尤其是與IR和NAFLD、糖尿病等發生發展密切相關。研究發現脂聯素表達降低與IR的發生發展密切相關，IR又致脂聯素水平進一步下降，脂聯素下調和IR之間是互為因果的關系［12］。研究表明IR時，脂聯素低表達，而NF-κB過表達，二者呈明顯負相關［13］，進一步研究提示IKK激活引起NF-kB活化可能與IR時脂肪組織脂聯素合成減少有關［14］。

抵抗素是由脂肪細胞分泌的肽類激素，在嚙齒類動物的機體生理代謝與調節中起重要作用［15］。Liu等研究說明抵抗素過表達與脂代謝紊亂和胰島素抵抗有關［16］。進一步研究表明，抵抗素可通過多種途徑抑制肝臟、骨骼肌和脂肪組織對胰島素的敏感性，抑制胰島素信號轉導，影響糖脂代謝，破壞血糖穩態，提高血脂水平，促進高血糖和高脂血癥形成，導致IR、2型糖尿病與NAFLD等的發生發展［17］。研究發現給予體外培養的3T3-L脂肪細胞一定濃度的胰島素，抵抗素能降低其37%葡萄糖攝取量［18］，抵抗素不僅能抑制胰島素受體底物 （IRS）的磷酸化而影響胰島素上游信號的正常傳導，還可通過激活NF-κB抑制其下游通路的傳導，而加重IR反應［19-20］。

由上述可見，IR與NF-κB、脂聯素和抵抗素異常表達密切相關，因此，調節其異常表達可能對改善IR狀態有重要意義。

目前，3T3-L1前脂肪細胞株被國內外學者廣泛用于有關IR研究，對成熟的3T3-L1脂肪細胞可采用多種方法誘導建立IR脂肪細胞模型，用地塞米松誘導成熟的3T3-L1脂肪細胞建立IR細胞模型是常用的經典方法［9-10，21］，本實驗采用此方法，結果培養48 h后，模型組脂肪細胞的葡萄糖消耗量顯著減少，與正常組比較，各個時點葡萄糖消耗量差異均有統計學意義 （P＜0.05），但各時點各組自身前后比較，差異無統計學意義，提示地塞米松誘導48h是該造模方法成功構建功IR細胞模型的關鍵節點，且模型穩定性較好，與以往類似研究結果一致。

本研究表明，IR時3T3-L1脂肪細胞NF-κB基因表達上調，脂聯素分泌減少，抵抗素分泌增多，再次證實NF-κB、脂聯素和抵抗素異常表達與IR密切相關，與上述研究結果相似，提示NF-κB異常表達與脂聯素和抵抗素異常分泌參與IR的發生，它們間相互作用機制有待進一步探索闡明。

健脾化痰方是我院治療NAFLD的有效專方，方中黨參、白術益氣健脾，切斷生痰濁之源；桂枝、茯苓、澤瀉、茵陳溫化痰濁；陳皮、姜半夏、荷葉、山楂燥濕化痰，消食理氣和胃，祛已成之痰滯；姜黃、丹參養血活血通絡，祛肝絡之瘀滯，諸藥合用，共奏健脾化痰，養肝通絡之功，取氣血并調，痰瘀并治之效。前期研究表明該方治療NAFLD療效顯著，可明顯改善機體血脂代謝、氧自由基代謝和調節有關脂肪細胞因子分泌功能［7-8］。本研究結果表明，健脾化痰方含藥血清培養48 h時，IR脂肪細胞葡萄糖消耗量顯著提高 （P＜0.05），其提高的幅度不及吡格列酮組 （P＜0.05），提示健脾化痰方和吡格列酮均可改善IR，吡格列酮優于健脾化痰方；上清中脂聯素量明顯高于模型組 （P＜0.05），其提高的幅度顯著高于吡格列酮組 （P＜0.05），提示健脾化痰方和吡格列酮均可使IR脂肪細胞增加脂聯素分泌，健脾化痰方優于吡格列酮；上清中抵抗素量明顯低于模型組 （P＜0.05），提示健脾化痰方和吡格列酮均可抑制IR脂肪細胞分泌抵抗素。由此可知，健脾化痰方改善脂肪細胞IR狀態可能與其調節IR脂肪細胞分泌脂聯素和抵抗素功能有關，這也是其治療NAFLD具有良好療效的機制之一。

NF-κB是一種重要的前炎癥因子基因的轉錄調控子，除在肝組織的炎性反應、氧化應激、肝細胞凋亡和再生中發揮著重要作用外［22］，還因其活化可致PI3K/Akt胰島素信號通路障礙在IR的形成和發展中有重要作用［23］，而IR又是NAFLD發病機制的中心事件，在NAFLD病情進程中起重要作用，表明NF-κB信號通路在IR和NAFLD發生發展中有重要作用。本研究結果表明，IR時，脂肪細胞NF-κB基因表達水平顯著升高 （P＜0.05），而健脾化痰方和吡格列酮均能顯著下調其表達 （P＜0.05），提示健脾化痰方和吡格列酮能下調IR時脂肪細胞NF-κB異常高表達，調節脂肪細胞因子分泌，改善IR。

綜上所述，NF-κB、脂聯素、抵抗素參與IR發生，健脾化痰方可能是通過抑制IR狀態時脂肪細胞NF-κB異常高表達，增加其脂聯素分泌和減少抵抗素分泌，從而改善IR，這也可能是其治療NAFLD作用機制之一。

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：1001-1528（2015）05-1083-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.035

2014-06-15

江蘇省中醫藥科技項目 （LZ09114）；常州市科技計劃項目 （CZ20120017）。

李保良 （1965—），男，博士，主任中醫師，從事中醫藥防治慢性脾胃疾病和脂肪肝機制研究。Tel：13912332933，E-mail：lbl513@163.com