枳殼分子生藥鑒別DNA片段篩選

張鑫+廖亮+李同建+徐玲玲+韓興杰+張壽文

摘要：設計特異性引物，對22份枳殼樣本進行擴增、測序，利用Genious軟件進行序列比對與人工校正，并查找低拷貝序列和ITS序列的雜合位點，利用Mega5.0軟件構建葉綠體序列進化系統樹。結果表明：acc1基因和ITS序列雜合率高，無法成功鑒別枳殼品種，葉綠體基因可以鑒別枳殼正品與偽品柚；葉綠體基因是枳殼品種鑒定的重要片段，為枳殼品種的鑒定奠定基礎。

關鍵詞：枳殼；鑒別；核基因；ITS；葉綠體基因

中圖分類號：S567.01文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2014）11-0020-06

枳殼為蕓香科植物酸橙（CitrusaurantiumL.）及其栽培變種的干燥未成熟果實，枳殼首載于《神農本草經》，宋朝以前所用枳殼的原植物為蕓香科枸橘（Poncirustrifoliata），明代原植物演變為蕓香科植物酸橙[1]。枳殼栽培歷史悠久，并常與柑橘林混交，不斷選擇產生了許多栽培品種，導致枳殼類藥材的來源復雜化。蔡逸平等對枳殼類藥材進行了品種整理和產地原植物調查，結果表明柑橘屬多種植物的果實在不同地區作枳殼用，酸橙（C.aurantium）及其變種臭橙（C.aurantium‘Xiucheng）、香橙（C.aurantium‘Xiangcheng）、枳橙（C.aurantium×Poncirustrifoliate）分布于長江流域及南方各省，以江西、四川、湖南等省產量最大，還包括香圓枳殼（C.wilsoniiTanaka）、甜橙枳殼[C.sinensis（L.）Osbeck]、紅河枳殼（C.hongheensisY.L.D.L）、宜昌枳殼（C.ichangensisSwingle）、蟹橙枳殼（C.junosTanaka）、柚枳殼[C.grandis（L.）Osbeck][2]。由于歷史原因和各地用藥習慣造成枳殼品種混亂，不法商家趁機摻入偽品，目前市場上主要以柚的未成熟果實充當枳殼[3]，其有效成分含量明顯低于枳殼正品，沒有達到臨床用藥的含量標準，造成了市場混亂，所以枳殼藥材的基源鑒別很重要。

DNA條形碼是近年來生物分類和鑒定的研究熱點和方向，該技術不受個體形態和發育階段的限制，具有獨一無二的可重復性，對于在形態上較難鑒定的同屬近緣種，可以利用較短的基因保守序列進行種的鑒定[4]。曹暉通過分析6種姜黃屬藥用植物的trnK基因，發現序列可變區包括matK基因編碼區和trnK外顯子與matK內含子之間的區域，共有6個單核苷酸多態（SNPs）位點、1個9bp的缺失重復序列和4、14bp插入重復序列，它們可以作為6種川產姜黃屬藥用植物的分子鑒定標記[5]。高建平等應用ITS序列比較了不同產地南五味子的基源植物華中五味子及混淆品綠葉五味子的差異及其規律，認為ITS序列可作為中藥南五味子與混淆品綠葉五味子良好的分子標記[6]。基因組中含有豐富的遺傳信息，運用核基因序列或葉綠體基因序列鑒定藥用植物及生藥，已成為分子生藥學領域的發展趨勢。本研究選取不同來源、不同類型的枳殼樣本22份，對15個低拷貝核基因序列、ITS序列、葉綠體基因進行篩選，以期獲得可以鑒別枳殼品種的DNA片段，并根據枳殼品種特征選取可以用于快速鑒定枳殼的分子標記方法。

1材料與方法

1.1材料

供試材料采集于江西省、湖南省、四川省三大枳殼產區。采集新鮮完整的嫩葉，用硅膠迅速干燥，于-80℃保存。22份試驗材料見表1。

1.2方法

1.2.1DNA提取用改良的CTAB法[7]提取DNA，于-20℃冰箱保存。

1.2.2引物設計與篩選

選取系統發育分析中常用的15個低拷貝序列，從甜橙全基因組中獲取以上低拷貝序列全長，設計48對引物，擴增以上序列內含子區域，以新干界埠的臭橙為DNA模板擴增，與甜橙對應序列進行比對，驗證為同源序列并確定突變速率后，選取2個片段對22份樣品進行擴增，檢測其變異速率，驗證片段的可用性。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，具體引物信息如表2。

1.2.3擴增與測序

PCR反應體系60μL：1×buffer，250μmol/LMgCl2，200μmol/LdNTP，3UTaqDNA聚合酶，2μLDNA模板，正向引物、反向引物各0.5μmol/L。反應程序：94℃預變性5min；94℃變性30s，退火（退火溫度由引物序列決定）30s，72℃延伸50s，35個循環；72℃延伸5min，10℃保存。擴增產物送往上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

1.2.4數據處理

利用Geneious軟件評價測序結果的序列質量，將正向序列、反向序列進行拼接，去除兩端質量較差的片段。同時使用該軟件的Findhybridizationsite功能查找低拷貝序列和ITS中的雜合位點，統計結果。將葉綠體基因psbA-trnH和trnL-F拼接，利用ClustalW軟件對已整理的序列進行比對，利用Mega5.0軟件的鄰接法（NJtree）構建22個枳殼樣本的系統樹，自展次數（bootstrap）為1000，其他參數設為默認值。

2結果與分析

2.148個擴增片段測序統計

測序結果顯示，acc1、ITS序列、葉綠體psbA-trnH和trnL-F序列擴增成功，其他核基因片段雖能擴增成功，但測序疊峰較多，序列判讀困難。

2.2acc1基因序列分析

由表3可見，acc1-1片段擴增長度為620～621bp，有34個突變位點，其中雜合位點有32個，雜合率高達97%，信息位點6個，變異位點占總序列長度的5.5%，信息位點占1.0%。由表4可見，acc1-2擴增片段長度為476～498bp，有12個突變位點，5個信息位點。

2.3ITS序列分析

ITS的擴增片段長度為464bp，共9個突變位點（表5），全部含有雜合位點，變異位點占總長度的2.0%；信息位點8個，占總長度的1.7%。ITS1長度為150bp，其中含有4個雜合位點，5.8S長度為165bp，沒有發生突變，ITS2長度為149bp，含有5個雜合位點。

2.4葉綠體片段序列分析

PsbA-trnH的擴增長度為415～419bp，有12個突變位點，10個信息位點，變異位點占總長度的2.9%，信息位點占總長度的2.4%。在166～173bp出現了ATGCCACT堿基的缺失，在296～297bp出現AA堿基的缺失。trnL-F片段的擴增長度為921～928bp，有3個突變位點，在301～306bp

處出現了GAAAAA堿基的缺失，在378～384bp處出現了AATCATT堿基的缺失。從圖1聚類結果可以看出，22個樣本主要聚為2支，A支為酸橙，B支為甜橙，C支為枳殼偽品柚。

3結論與討論

3.1測序產生疊峰的原因

擴增的48個片段中測序正常的只有acc1-1、acc1-2、ITS、psbA-trnH、trnL-F等5個片段，其他核基因測序疊峰過多的原因可以歸納為2個方面：（1）選取的低拷貝基因在其他類群中雖然為低拷貝序列，但在枳殼中可能不是低拷貝；（2）枳殼是栽培果樹，種群雜合度高，這與栽培品種選育過程中的定向高度選擇有關[8-9]，擴增產物雜合性較高導致測序失敗，通過挑取單克隆可以正常測序，但由于其來源復雜，不適用于中藥材的快速鑒定。

3.2acc1核基因序列的特征

只有7、18號樣本的acc1基因為純合，其他樣本都含有雜合位點，表明acc1基因可能為單拷貝基因。Gornicki等研究發現，六倍體小麥質體Accase基因（acc1）為單拷貝核基因，被定位在染色體短臂普通小麥第二同源群上[10]，acc1基因的染色體定位、基因專一性及其在絕大多數禾本科植物中都是單拷貝的[11-12]。單拷貝基因出現較多的雜合位點，可能與枳殼品種本身的雜合程度較高有關，高度的雜合性導致低拷貝核基因疊峰較多，測序困難，因此單拷貝核基因可能不適

用于枳殼品種的鑒定。

3.3ITS序列特征

ITS的長度和序列變化較大，常用于物種鑒定和系統進化研究[13]。ITS為串聯重復序列，研究時必須考慮這些拷貝在基因組內的變異，但其存在一致性進化的特征，使整個基因組內所有拷貝趨于均一化，而且這種均一化似乎在大多數物種中相當有代表性。相對于ITS2而言，ITS1序列較長，演化速率較快，種內變異較大，ITS2和5.8S比較保守[14]。Chen等測試了ITS2對藥用植物的鑒定能力，建議ITS2作為藥用植物鑒定的標準條形碼序列[15]。ITS2更適用于藥材和標本等DNA已部分降解的樣品鑒定，ITS2序列變異較大，并且具備二級結構，為鑒別物種提供獨特的分子形態特征。但本研究顯示，ITS共有9個突變位點，但全部含有雜合位點，表明序列的雜合性很高，可能與枳殼頻繁的自然雜交或人為的雜交育種有關。枳殼生命周期長，嫁接及無融合生殖等無性繁殖方式使得一致性進化速度較慢，雜合位點長期存在于基因組中，因此ITS序列不適合被應用于枳殼品種的鑒定。

3.4葉綠體基因的擴增

與核基因序列相比，葉綠體基因組DNA具有分子量小、拷貝數量多、結構簡單等特點，這些都有利于對葉綠體基因組進行分析[16]。葉綠體基因組保守性較強，含有特征性的重復順序，它的遺傳方式多以母系遺傳為主，具有單親遺傳特點，不受物種雜合性影響[17]。由psbA-trnH、trnL-F聚類圖可知，不同產區的22個枳殼樣品主要分為A、B2支，其中A支由酸橙組成，自展支持率為80%，B支由甜橙組成，C支為市場上常用的偽品柚，從圖1中能區分開枳殼的偽品與正品。psbA-trnH位于編碼光合系統Ⅱ反應中心的D1蛋白的psbA基因和編碼tRNA組氨酸的trnH基因之間，被認為是被子植物葉綠體基因組中變異位點最多的序列之一，由于psbA-trnH、trnL-F基因的非編碼區受外界選擇壓力小，進化速率較快，因此已被廣泛應用于藥用植物種間的鑒別研究[18-19]。本研究表明，葉綠體基因可以區別枳殼及其偽品柚，據報道，葉綠體基因同樣成功地鑒別了其他藥用植物，如Yang等對大黃屬13個種、26個居群、49個樣本的trnL-F間隔區的序列進行了測定和分析，找出了大黃屬植物該段序列的變異特征，根據分析結果設計了大黃特異性引物，用于鑒別大黃，結果理想[18]。Han等應用psbA-trnH序列成功鑒定了肉蓯蓉及其偽品[20]。這些研究結果為實現藥用植物品種的分子鑒別奠定了基礎。本研究通過將psbA-trnH、trnL-F這2個片段序列用于枳殼品種的鑒定，為中藥材的鑒定提供分子方面的證據，以期更好地保證中藥材質量。

3.5結論

本研究用acc1等15個低拷貝核基因序列、ITS序列、葉綠體基因對22個枳殼樣本進行擴增，測序正常的只有acc1-1、acc1-2、ITS序列、psbA-trnH序列、trnL-F序列，結果表明acc1等低拷貝核基因序列和ITS序列都不適用于藥用植物枳殼的品種鑒別，原因可能是枳殼頻繁雜交導致的雜合位點長期存在于基因組中，然而葉綠體的psbA-trnH、trnL-F序列不受雜交影響，可以把偽品與枳殼正品區分開，但有些分支的支持度較低，在以后研究中可以使用多個葉綠體片段組合對枳殼的遺傳關系進行更準確的研究。雖然本研究篩選的以上序列無法鑒定枳殼品種來源，但psbA-trnH、trnL-F這2個葉綠體基因間隔區可以將甜橙、酸橙及柚區分開，為利用分子標記技術鑒別枳殼品種及辨偽工作奠定了基礎。

參考文獻：

[1]謝宗萬.論枳實、枳殼古今藥用品種的延續與變遷[J].中醫藥研究，1991，1（1）：19-22.

[2]蔡逸平，曹嵐，范崔生.枳殼、枳實類藥材的品種考證和資源應用的調查研究[J].江西中醫學院學報，1998，10（4）：184-186.

[3]于文敏，高賓，孫利生.枳殼的炮制加工與偽品鑒別[J].首都醫藥，2009（11）：38.

[4]LahayeR，vanderBankM，BogarinD，etal.DNAbarcodingtheflorasofbiodiversityhotspots[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica，2008，105（8）：2923-2928.

[5]曹暉.6種川產姜黃屬藥用植物葉綠體trnK基因序列變異分析及其分子鑒定[J].藥學學報，2003，38（11）：871-875.

[6]高建平，王彥涵，喬春峰，等.中藥南五味子及其混淆品綠葉五味子果實的ITS序列分析[J].中國中藥雜志，2003，28（8）：706-710.

[7]廖亮，李同建，劉中來，等.基于細胞學和DNA序列的苧麻與其野生近緣類群系統關系研究[J].作物學報，2009，35（10）：1778-1790.

[8]暴朝霞，黃宏文.板栗主栽品種的遺傳多樣性及其親緣關系分析[J].園藝學報，2002，29（1）：13-19.

[9]馮超，朱長青，徐昌杰，等.RNA-Seq在果樹學研究中的應用[J].果樹學報，2014（1）：115-124.[HJ1.72mm]

[10]GornickiP，FarisJ，KingI，etal.Plastid-localizedacetyl-CoAcarboxylaseofbreadwheatisencodedbyasinglegeneoneachofthethreeancestralchromosomesets[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica，1997，94（25）：14179-14184.

[11]HuangSX，SirikhachornkitA，SuXJ，etal.Genesencodingplastidacetyl-CoAcarboxylaseand3-phosphoglyceratekinaseoftheTriticum/Aegilopscomplexandtheevolutionaryhistoryofpolyploidwheat[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica，2002，99（12）：8133-8138.

[12]FarisJ，SirikhachornkitA，HaselkornR，etal.Chromosomemappingandphylogeneticanalysisofthecytosolicacetyl-CoAcarboxylaselociinwheat[J].MolecularBiologyandEvolution，2001，18（9）：1720-1733.

[13]álvarezI，WendelJF.RibosomalITSsequencesandplantphylogeneticinference[J].MolecularPhylogeneticsandEvolution，2003，29（3）：417-434.

[14]QuijadaA，ListonA，DelgadoP，etal.VariationinthenuclearribosomalDNAinternaltranscribedspacer（ITS）regionofPinusrzedowskiirevealedbyPCR-RFLP[J].TheoreticalandAppliedGenetics，1998，96（3/4）：539-544.

[15]ChenSL，YaoH，HanJP，etal.ValidationoftheITS2regionasanovelDNAbarcodeforidentifyingmedicinalplantspecies[J].PLOSOne，2010，5（1）：e8613.

[16]黃瑤，李朝鑾，馬誠，等.葉綠體DNA及其在植物系統學研究中的應用[J].植物學通報，1994（2）：11-25.

[17]李文哲.植物葉綠體DNA與線粒體DNA的遺傳變異[J].細胞生物學雜志，1988（1）：5-10.

[18]YangM，ZhangD，LiuJ，etal.AmolecularmarkerthatisspecifictomedicinalrhubarbbasedonchloroplasttrnL/trnFsequences[J].PlantaMedica，2001，67（8）：784-786.

[19]KojomaM，KuriharaK，YamadaKazuya，etal.Geneticidentificationofcinnamon（Cinnamomumspp.）basedonthetrnL-trnFchloroplastDNA[J].PlantaMedica，2002，68（1）：94-96.

[20]HanJP，SongJY，LiuC，etal.IdentificationofCistanchespecies（Orobanchaceae）basedonsequencesoftheplastidpsbA-trnHintergenicregion[J].ActaPharmaceuticaSinica，2010，45（1）：126-130.

[2]蔡逸平，曹嵐，范崔生.枳殼、枳實類藥材的品種考證和資源應用的調查研究[J].江西中醫學院學報，1998，10（4）：184-186.

[3]于文敏，高賓，孫利生.枳殼的炮制加工與偽品鑒別[J].首都醫藥，2009（11）：38.

[4]LahayeR，vanderBankM，BogarinD，etal.DNAbarcodingtheflorasofbiodiversityhotspots[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica，2008，105（8）：2923-2928.

[5]曹暉.6種川產姜黃屬藥用植物葉綠體trnK基因序列變異分析及其分子鑒定[J].藥學學報，2003，38（11）：871-875.

[6]高建平，王彥涵，喬春峰，等.中藥南五味子及其混淆品綠葉五味子果實的ITS序列分析[J].中國中藥雜志，2003，28（8）：706-710.

[7]廖亮，李同建，劉中來，等.基于細胞學和DNA序列的苧麻與其野生近緣類群系統關系研究[J].作物學報，2009，35（10）：1778-1790.

[8]暴朝霞，黃宏文.板栗主栽品種的遺傳多樣性及其親緣關系分析[J].園藝學報，2002，29（1）：13-19.

[9]馮超，朱長青，徐昌杰，等.RNA-Seq在果樹學研究中的應用[J].果樹學報，2014（1）：115-124.[HJ1.72mm]

[10]GornickiP，FarisJ，KingI，etal.Plastid-localizedacetyl-CoAcarboxylaseofbreadwheatisencodedbyasinglegeneoneachofthethreeancestralchromosomesets[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica，1997，94（25）：14179-14184.

[11]HuangSX，SirikhachornkitA，SuXJ，etal.Genesencodingplastidacetyl-CoAcarboxylaseand3-phosphoglyceratekinaseoftheTriticum/Aegilopscomplexandtheevolutionaryhistoryofpolyploidwheat[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica，2002，99（12）：8133-8138.

[12]FarisJ，SirikhachornkitA，HaselkornR，etal.Chromosomemappingandphylogeneticanalysisofthecytosolicacetyl-CoAcarboxylaselociinwheat[J].MolecularBiologyandEvolution，2001，18（9）：1720-1733.

[13]álvarezI，WendelJF.RibosomalITSsequencesandplantphylogeneticinference[J].MolecularPhylogeneticsandEvolution，2003，29（3）：417-434.

[14]QuijadaA，ListonA，DelgadoP，etal.VariationinthenuclearribosomalDNAinternaltranscribedspacer（ITS）regionofPinusrzedowskiirevealedbyPCR-RFLP[J].TheoreticalandAppliedGenetics，1998，96（3/4）：539-544.

[15]ChenSL，YaoH，HanJP，etal.ValidationoftheITS2regionasanovelDNAbarcodeforidentifyingmedicinalplantspecies[J].PLOSOne，2010，5（1）：e8613.

[16]黃瑤，李朝鑾，馬誠，等.葉綠體DNA及其在植物系統學研究中的應用[J].植物學通報，1994（2）：11-25.

[17]李文哲.植物葉綠體DNA與線粒體DNA的遺傳變異[J].細胞生物學雜志，1988（1）：5-10.

[18]YangM，ZhangD，LiuJ，etal.AmolecularmarkerthatisspecifictomedicinalrhubarbbasedonchloroplasttrnL/trnFsequences[J].PlantaMedica，2001，67（8）：784-786.

[19]KojomaM，KuriharaK，YamadaKazuya，etal.Geneticidentificationofcinnamon（Cinnamomumspp.）basedonthetrnL-trnFchloroplastDNA[J].PlantaMedica，2002，68（1）：94-96.

[20]HanJP，SongJY，LiuC，etal.IdentificationofCistanchespecies（Orobanchaceae）basedonsequencesoftheplastidpsbA-trnHintergenicregion[J].ActaPharmaceuticaSinica，2010，45（1）：126-130.

[2]蔡逸平，曹嵐，范崔生.枳殼、枳實類藥材的品種考證和資源應用的調查研究[J].江西中醫學院學報，1998，10（4）：184-186.

[3]于文敏，高賓，孫利生.枳殼的炮制加工與偽品鑒別[J].首都醫藥，2009（11）：38.

[4]LahayeR，vanderBankM，BogarinD，etal.DNAbarcodingtheflorasofbiodiversityhotspots[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica，2008，105（8）：2923-2928.

[5]曹暉.6種川產姜黃屬藥用植物葉綠體trnK基因序列變異分析及其分子鑒定[J].藥學學報，2003，38（11）：871-875.

[6]高建平，王彥涵，喬春峰，等.中藥南五味子及其混淆品綠葉五味子果實的ITS序列分析[J].中國中藥雜志，2003，28（8）：706-710.

[7]廖亮，李同建，劉中來，等.基于細胞學和DNA序列的苧麻與其野生近緣類群系統關系研究[J].作物學報，2009，35（10）：1778-1790.

[8]暴朝霞，黃宏文.板栗主栽品種的遺傳多樣性及其親緣關系分析[J].園藝學報，2002，29（1）：13-19.

[9]馮超，朱長青，徐昌杰，等.RNA-Seq在果樹學研究中的應用[J].果樹學報，2014（1）：115-124.[HJ1.72mm]

[10]GornickiP，FarisJ，KingI，etal.Plastid-localizedacetyl-CoAcarboxylaseofbreadwheatisencodedbyasinglegeneoneachofthethreeancestralchromosomesets[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica，1997，94（25）：14179-14184.

[11]HuangSX，SirikhachornkitA，SuXJ，etal.Genesencodingplastidacetyl-CoAcarboxylaseand3-phosphoglyceratekinaseoftheTriticum/Aegilopscomplexandtheevolutionaryhistoryofpolyploidwheat[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica，2002，99（12）：8133-8138.

[12]FarisJ，SirikhachornkitA，HaselkornR，etal.Chromosomemappingandphylogeneticanalysisofthecytosolicacetyl-CoAcarboxylaselociinwheat[J].MolecularBiologyandEvolution，2001，18（9）：1720-1733.

[13]álvarezI，WendelJF.RibosomalITSsequencesandplantphylogeneticinference[J].MolecularPhylogeneticsandEvolution，2003，29（3）：417-434.

[14]QuijadaA，ListonA，DelgadoP，etal.VariationinthenuclearribosomalDNAinternaltranscribedspacer（ITS）regionofPinusrzedowskiirevealedbyPCR-RFLP[J].TheoreticalandAppliedGenetics，1998，96（3/4）：539-544.

[15]ChenSL，YaoH，HanJP，etal.ValidationoftheITS2regionasanovelDNAbarcodeforidentifyingmedicinalplantspecies[J].PLOSOne，2010，5（1）：e8613.

[16]黃瑤，李朝鑾，馬誠，等.葉綠體DNA及其在植物系統學研究中的應用[J].植物學通報，1994（2）：11-25.

[17]李文哲.植物葉綠體DNA與線粒體DNA的遺傳變異[J].細胞生物學雜志，1988（1）：5-10.

[18]YangM，ZhangD，LiuJ，etal.AmolecularmarkerthatisspecifictomedicinalrhubarbbasedonchloroplasttrnL/trnFsequences[J].PlantaMedica，2001，67（8）：784-786.

[19]KojomaM，KuriharaK，YamadaKazuya，etal.Geneticidentificationofcinnamon（Cinnamomumspp.）basedonthetrnL-trnFchloroplastDNA[J].PlantaMedica，2002，68（1）：94-96.

[20]HanJP，SongJY，LiuC，etal.IdentificationofCistanchespecies（Orobanchaceae）basedonsequencesoftheplastidpsbA-trnHintergenicregion[J].ActaPharmaceuticaSinica，2010，45（1）：126-130.