兩種不同形狀碳酸鈣微米顆粒對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及成骨分化影響的研究

谷子芽 李 穎 傅 婷 張文元 楊亞冬 張科技

外傷、感染以及腫瘤都會導(dǎo)致骨損傷，其修復(fù)過程依賴于骨組織的再生。隨著干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，結(jié)合干細(xì)胞和生物材料的組織工程是骨再生醫(yī)學(xué)中的一種新的治療手段［1］。間充質(zhì)干細(xì)胞是( mesenchymal stem cells，MSCs) 一類成纖維樣細(xì)胞，可自我更新和多向分化，具有很強(qiáng)的克隆形成能力。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在地塞米松，骨形態(tài)蛋白( BMP) 等誘導(dǎo)因子的作用下，易于成骨分化，因此是一種具有良好應(yīng)用前景的種子細(xì)胞［2，3］。碳酸鈣( CaCO3) 是石灰石的主要無機(jī)成分，無生物毒性，組織相容性較好，自然界來源廣泛，不僅在工業(yè)應(yīng)用有廣泛使用，近年來在藥學(xué)，生物學(xué)等領(lǐng)域也有應(yīng)用報道，可作為藥物載體或組織工程支架材料［4～6］。碳酸鈣顆粒其粒徑大小與形狀易于控制，也是骨組織工程支架材料之一。近年來，隨著納米、微米級顆粒材料的普遍應(yīng)用，對這些微顆粒材料的生物相容性評價顯得更為重要。

本研究通過原代培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，檢測兩種不同形狀碳酸鈣微粒( 球形和方形) 對細(xì)胞行為的影響，研究碳酸鈣微粒與間充質(zhì)干細(xì)胞的生物相容性，為骨組織工程材料應(yīng)用中碳酸鈣的選擇與優(yōu)化提供了參考。

材料與方法

1.材料：低糖DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基( Hyclone 公司) ，胎牛血清( fetal bovin serum，F(xiàn)BS，四季青) ，青-鏈霉素100 ×母液( Gibco 公司) ，地塞米松( dexamethasone，Dex，Sigma 公司) ，β-磷酸甘油鈉( β-glycerophosphat，β -GP，Sigma 公司) ，維生素C( vitamin C，Sigma 公司) ，MTS 細(xì)胞增殖檢測試劑盒Cell-Titer 96?AQueous one solution reagent( Promega 公司) ，堿性磷酸酶染色試劑盒( Sigma 公司) ，堿性磷酸酶活性試劑盒( 南京建成) ，BCA 蛋白濃度檢測試劑盒( 碧云天公司) ，茜素紅，DCFH-DA( Sigma 公司) ，抗大鼠CD29 -FITC、CD44 -FITC、CD90 -FITC、CD106 -PE 熒光標(biāo)記流式抗體( 均購自Biolegend 公司) 。SD 大鼠購于浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心。

2.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng)： SD 大鼠( 15 天左右) 脫頸處死后75%乙醇浸泡3min。無菌條件下分離雙下肢股骨脛骨，去除表面附著的肌肉。剪去骨兩端，PBS 沖洗骨髓腔，收集沖洗液，1000r/min 離心5min。用含血清培養(yǎng)液重懸后接種入細(xì)胞培養(yǎng)皿。細(xì)胞培養(yǎng)液為添加10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的低糖DMEM 培養(yǎng)基。流式細(xì)胞術(shù)分析P3代細(xì)胞表面間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記CD29、CD44、CD90、CD106 的表達(dá)。

3.碳酸鈣微粒制備： 兩種不同形狀的碳酸鈣微粒由浙江理工大學(xué)合成并提供。球形碳酸鈣微粒的合成： 將100ml CaCl2溶液(0.2mol/L) 加入800ml 絲膠蛋白溶液( silk sericin，2g/L) ，25℃下持續(xù)攪拌30min。使用NaOH( 0.1mol/L) 將溶液pH 值調(diào)節(jié)至7，然后加入100ml Na2CO3溶液(0.2mol/L) ，40℃攪拌反應(yīng)180min。之后將獲得的碳酸鈣微粒用乙醇和去離子水清洗3 遍，60℃下干燥48h。方形碳酸鈣微粒合成方法相似，但不需要加入絲膠蛋白。利用掃描電子顯微鏡( S4800，Hitachi 公司) 觀察材料微觀形貌。

4.碳酸鈣微粒懸液及條件培養(yǎng)液制備： 兩種形狀的碳酸鈣微粒經(jīng)160℃高溫干烤2h 滅菌后懸浮于培養(yǎng)液獲得10mg/ml 母液。進(jìn)一步以培養(yǎng)液濃度梯度稀釋獲得50、100、200、400μg/ml 碳酸鈣微粒懸液與細(xì)胞共培養(yǎng)。將各濃度碳酸鈣微粒懸液4℃下保存24h 后，12000r/min 離心5min，吸取上清即為碳酸鈣微粒的條件培養(yǎng)液。對照組為普通培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞。

5.細(xì)胞增殖： 細(xì)胞以5 ×103/孔的密度接種入96 孔板。隔夜貼壁后，加入碳酸鈣微粒懸液和條件培養(yǎng)液，每孔加入200μl，共培養(yǎng)7 天后，進(jìn)行MTS 檢測，每組設(shè)置4 個復(fù)孔。普通培養(yǎng)液組作為對照。按試劑盒說明書操作，最后酶標(biāo)儀490nm 波長讀取吸光度。以對照組吸光度均值為基準(zhǔn)(100%) ，計算細(xì)胞增殖抑制率( %) =( A490實驗組/A490對照組) ×100%。

6.顆粒黏附：細(xì)胞以2 ×105/皿的密度接種至35mm 培養(yǎng)皿，待90%匯合后，棄原培養(yǎng)液，加入兩種形狀的碳酸鈣微粒懸液(400μg/ml，每孔2ml) 。換液后4h 及24h 進(jìn)行茜素紅染色觀察黏附的微粒。細(xì)胞PBS 清洗3 遍后，4%多聚甲醛固定30min。去離子水清洗后，加入茜素紅染液( 10mg/ml) 染色5min。去離子水清洗，照相。

7.活性氧( reactive oxygen species，ROS) 檢測： 細(xì)胞按4 ×104/孔接種入24 孔板，貼壁過夜后加入兩種碳酸鈣微粒懸液(400μg/ml 每孔0.5ml) ，同時設(shè)立雙氧水( 200μmol/L) 處理組作為陽性對照。24h 后PBS 清洗，加入用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA( 終濃度10μmol/L) ，培養(yǎng)箱孵育30min，PBS 清洗后488nm 激發(fā)波長下熒光顯微鏡( Olympus 公司) 觀察。

8.堿性磷酸酶( alkaline phosphatase，ALP) 活性： 細(xì)胞按4 ×104/孔接種入24 孔板，貼壁過夜后加入碳酸鈣微粒懸液24h，換用成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)( DMEM +10%FBS +10nmol/L Dex+10mmol/L β-GP+80μg/ml 維生素C +1%青-鏈霉素) ，每隔2 ～3 天換液。成骨誘導(dǎo)2 周后進(jìn)行堿性磷酸酶活性的檢測。每孔細(xì)胞PBS 清洗后加入400μl 0.1% Triton X-100，置4℃冰箱過夜。觀察已無完整細(xì)胞結(jié)構(gòu)，經(jīng)震蕩后，離心取裂解液上清。其余步驟按試劑盒說明書進(jìn)行，520nm 波長下測定吸光度，每組設(shè)置3 個復(fù)孔，以BCA 法測定總蛋白量對磷酸酶活性標(biāo)準(zhǔn)化，562nm 波長下測定吸光度。最后獲得標(biāo)準(zhǔn)化ALP 活性值( A520/A562) 。

9.堿性磷酸酶染色：實驗組設(shè)置與處理同ALP 活性檢測實驗。成骨誘導(dǎo)2 周后，按堿性磷酸酶染色試劑盒要求分別固定、染色、拍照。

10.統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件完成統(tǒng)計處理，ANOVA 方差分析，Origin 7.0 做圖。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)： 大鼠MSC 細(xì)胞呈成纖維樣，細(xì)胞克隆大約在第5 ～7 天出現(xiàn)，生長迅速。流式細(xì)胞分析表明大部分細(xì)胞高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志CD29、CD44、CD90( ＞85%) ； 但CD106 表達(dá)相對較低(5.74%) ，細(xì)胞均一性較好( 圖1) 。

2.碳酸鈣微粒及表征：絲膠蛋白的加入對碳酸鈣微粒的形狀有重要影響。SEM 結(jié)果顯示： 加入絲膠蛋白組形成的碳酸鈣微粒呈圓形( 圖2A) ，而未加入絲膠蛋白組的碳酸鈣微粒成方形( 圖2B) 。兩種微粒的直徑都在6.5μm 左右。

圖1 大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志流式分析

圖2 兩種合成條件下形成碳酸鈣微粒的SEM 形態(tài)

3.不同形狀碳酸鈣微粒對細(xì)胞增殖的影響：MTS結(jié)果顯示：兩種形狀碳酸鈣微粒直接與細(xì)胞共培養(yǎng)可抑制細(xì)胞增殖，且呈濃度依賴性( 圖3A) 。以對照組吸光度為對象進(jìn)行ANOVA分析，結(jié)果表明方形碳酸鈣微粒對細(xì)胞增殖的抑制作用更明顯，200μg/ml 濃度下，球形碳酸鈣微粒未對細(xì)胞增殖造成明顯影響，而方形微粒已出現(xiàn)明顯抑制作用( P ＜0. 05) 。在400μg/ml 濃度下，兩種微粒均有明顯細(xì)胞增殖抑制作用( P ＜0.05) 。50 和100μg/ml 微粒濃度不會對細(xì)胞增殖產(chǎn)生抑制。所有實驗濃度下，兩種碳酸鈣微粒的條件培養(yǎng)液均未對細(xì)胞增殖造成明顯影響，且球形顆粒與方形顆粒的條件培養(yǎng)液之間不存在顯著差別( 圖3B) 。說明碳酸鈣微粒造成的細(xì)胞抑制作用與濃度密切相關(guān)，且主要由微粒與細(xì)胞間的直接接觸引起，因此微粒形狀可對細(xì)胞狀態(tài)產(chǎn)生影響。

圖3 MTS 檢測不同濃度微粒及其條件培養(yǎng)液對細(xì)胞增殖的影響

4.不同形狀碳酸鈣微粒在細(xì)胞表面的黏附：茜素紅可與鈣離子結(jié)合，因此可檢測黏附于細(xì)胞表面的碳酸鈣顆粒。碳酸鈣黏附于細(xì)胞表面的量與時間相關(guān)。兩者共培養(yǎng)4h 時，大部分顆粒未黏附于細(xì)胞表面；24h 后，黏附顆粒量明顯增加。兩種共培養(yǎng)條件下，球形顆粒與細(xì)胞表面的黏附能力均明顯高于方形顆粒( 圖4) 。這可能與圓形微粒表面光滑，易于與細(xì)胞表面基質(zhì)蛋白結(jié)合從而黏附于細(xì)胞表面，而方形顆粒結(jié)合相對疏松，容易被洗脫。

5.不同形狀碳酸鈣微粒對細(xì)胞ROS 的影響：ROS檢測表明：球形顆粒與方形顆粒在高濃度(400μg/ml)下都不會對細(xì)胞ROS 造成明顯影響。H2O2作用可明顯增加細(xì)胞ROS，造成細(xì)胞活性氧損傷，而碳酸鈣微粒與細(xì)胞共培養(yǎng)不會產(chǎn)生ROS 細(xì)胞損傷( 圖5) 。

圖4 茜素紅染色檢驗兩種碳酸鈣顆粒與細(xì)胞共培養(yǎng)4h 和24h 后，在細(xì)胞表面的黏附情況

圖5 ROS 活性氧檢測

6.不同形狀碳酸鈣微粒對細(xì)胞成骨分化的影響：間充質(zhì)干細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)液作用下可發(fā)生成骨分化，堿性磷酸酶ALP 活性提高是成骨分化的重要標(biāo)志之一。碳酸鈣微粒與細(xì)胞共培養(yǎng)可明顯抑制ALP 活性，且呈一定濃度依賴性。ALP 染色顯示高濃度碳酸鈣微粒(400μg/ml) 下染色強(qiáng)度明顯低于對照組和低濃度碳酸鈣微粒處理組( 圖6) 。ALP 活性檢測結(jié)果相似：所有濃度下碳酸鈣微粒均造成ALP 活性降低，高濃度( 400μg/ml) 下，方形碳酸鈣微粒顯示最高ALP 活性抑制能力，明顯低于相同濃度下的球形碳酸鈣微粒( 圖7) 。

討 論

圖6 ALP 染色法檢測球形和方形碳酸鈣微粒對ALP 活性影響

圖7 ALP 活性檢測

細(xì)胞和支架材料是組織工程中最重要的兩個部分。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有高度自我更新能力和多向分化能力，是組織工程中常用的“種子細(xì)胞”。碳酸鈣微粒是常用的骨組織工程支架材料之一，同時也是模版法合成羥基磷灰石微粒的重要前體［7］。由于碳酸鈣微粒的粒徑、形狀易于調(diào)控，對控制羥基磷灰石的性狀也具有重要意義［8］。近年來研究表明： 無機(jī)材料的粒徑、形狀對細(xì)胞毒性有重要影響［9，10］。目前研究普遍認(rèn)為大部分納米級材料毒性高于微米級材料，但材料形狀的影響研究相對較少。本研究合成了兩種不同形狀的碳酸鈣微粒，探討其對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、分化等影響，為支架材料的選擇與生物毒性研究打下基礎(chǔ)。

隨著微米、納米級材料在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用的增加，對材料生物相容性和毒性評價的研究更為重要。本研究使用了球形和方形兩種不同形狀，粒徑相似的碳酸鈣微粒，比較了它們對間充質(zhì)干細(xì)胞的生物毒性。兩種顆粒在高濃度下均對細(xì)胞增殖造成抑制，相同濃度處理下方形微粒抑制能力明顯高于球形顆粒。然而微粒條件培養(yǎng)液不會造成細(xì)胞增殖抑制，說明微粒造成的細(xì)胞增殖抑制主要是由于細(xì)胞和微粒的直接接觸造成的。ROS 是生物有氧代謝過程中的一類產(chǎn)物，包括氧離子、過氧化物和含氧自由基等，是正常氧代謝的副產(chǎn)物，在正常細(xì)胞信號通路中也有重要作用。然而，一些外界刺激導(dǎo)致明顯的細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損壞，可引起ROS 的量急劇增多，被稱為氧化應(yīng)激反應(yīng)。本研究顯示，高濃度下兩種碳酸鈣微粒與細(xì)胞共培養(yǎng)并不會造成細(xì)胞ROS 損傷，說明碳酸鈣微粒造成的細(xì)胞毒性不是通過ROS 提高引起的。碳酸鈣微粒對細(xì)胞成骨分化影響實驗與細(xì)胞增殖實驗結(jié)果相似。球形和方形碳酸鈣微粒均抑制ALP 活性，高濃度微粒的抑制更明顯。相同濃度下，方形碳酸鈣微粒造成ALP 活性抑制更顯著。這可能與方形微粒抑制細(xì)胞增殖更嚴(yán)重有關(guān)。

Huang 等［11］發(fā)現(xiàn)納米顆粒對細(xì)胞毒性明顯高于微米顆粒，可造成ROS 明顯上升。Zhao 等［10］則發(fā)現(xiàn)納米顆粒的形狀對細(xì)胞毒性有重要影響。ROS 是納米顆粒細(xì)胞毒性的主要原因之一，這可能與細(xì)胞吞噬納米顆粒造成細(xì)胞內(nèi)環(huán)境改變有關(guān)。納米顆粒形狀對細(xì)胞膜完整性影響也是造成納米顆粒毒性的重要原因［12］。微米級顆粒形狀對細(xì)胞影響未見相關(guān)報道，細(xì)胞對微米顆粒的吞噬低于納米顆粒，因此微米顆粒毒性較低。MSC 本身屬于非吞噬細(xì)胞，微米顆粒進(jìn)入細(xì)胞量可能較少，然而微粒形狀仍可對細(xì)胞生理活動產(chǎn)生一定影響，這可能是通過對細(xì)胞膜作用產(chǎn)生的。球形微粒表面光滑，對細(xì)胞膜刺激可能低于相似粒徑的方形微粒。本研究后續(xù)擬對兩種微粒制備2D 或3D 材料支架，進(jìn)一步研究細(xì)胞在微粒表面的行為差別，觀察不同形狀微粒表面與細(xì)胞膜接觸造成的刺激對細(xì)胞行為的影響，以期對顆粒形狀造成細(xì)胞行為影響的機(jī)制進(jìn)行深入探討。

綜上所述，以間充質(zhì)干細(xì)胞為模型研究表明，球形碳酸鈣微粒的生物相容性優(yōu)于相同粒徑的方形碳酸鈣微粒。球形微粒在流動性上也較方形微粒更為理想，更適合應(yīng)用于支架材料的制備。因此，盡管球形微粒制備工藝更為復(fù)雜，其仍是組織工程應(yīng)用的理想選擇。

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