2種取代苯對花翅搖蚊毒性和細胞色素P450酶活性的影響

牛 芳，謝 菲，張 健，吳韶平，李小鵬，王志英，曹傳旺*

(1.東北林業大學林學院，黑龍江哈爾濱 150040；2.江西省林業有害生物防治檢疫局，江西南昌 330038)

2種取代苯對花翅搖蚊毒性和細胞色素P450酶活性的影響

牛 芳1，謝 菲2，張 健1，吳韶平1，李小鵬1，王志英1，曹傳旺1*

(1.東北林業大學林學院，黑龍江哈爾濱 150040；2.江西省林業有害生物防治檢疫局，江西南昌 330038)

[目的]明確取代苯類污染物對水生昆蟲毒性及細胞色素P450酶活性的影響。[方法]運用藥液培養法和酶活性測定法分析了對氯苯酚和對苯二胺對花翅搖蚊4齡幼蟲毒性及細胞色素P450酶活體和離體活性的影響效應。[結果]對氯苯酚和對苯二胺對花翅搖蚊4齡幼蟲的24 h半數致死濃度(LC50)分別為38.65和78.43 mg/L。對氯苯酚對花翅搖蚊4齡幼蟲體內P450酶活性作用主要表現為隨作用時間增加抑制作用減??；而對苯二胺則主要表現為隨作用濃度增加誘導作用增強。對氯苯酚和對苯二胺對花翅搖蚊4齡幼蟲離體P450酶活性的半數抑制濃度(IC50)分別為466.15和594.43 mg/L。[結論]花翅搖蚊細胞色素P450可作為監測對氯苯酚和對苯二胺水體污染的參考生物化學標志物。

花翅搖蚊；對氯苯酚；對苯二胺；細胞色素P450；毒性；活性

取代苯作為一類環境有機污染物，主要以工業廢液等形式排放到江、河、湖、海等水體生態系統中[1]，一方面對水生生物造成直接危害，另一方面通過污染水生態環境對水生生物的生長發育造成不可逆的影響，從而進一步通過食物鏈傳遞和遷移危及到人和牲畜的健康[2-3]。對氯苯酚廣泛用于化學工業，是我國優先控制污染物[4]。對苯二胺是目前使用最廣泛的氧化型染發劑的重要成分之一，與雙氧水混合氧化后形成大分子色素使頭發永久性著色[5]。探討對氯苯酚和對苯二胺在生物體內的代謝途徑和生物的應激解毒機制，尋找生物標志物監測該類污染物間接為保證人類健康提供參考。

細胞色素P450酶系作為生物標志物，因其可催化體內多種反應(環氧化作用、O-脫羥基作用、N-脫羥基作用)，可代謝包括殺蟲劑、多環芳烴、鹵化烴等約25萬種外源性化合物[6]，尤其是生物體內P450酶系活性變化常用于環境污染物的監測[7]。搖蚊是一種水生態系統中普遍存在且數量眾多的底棲生物，具有容易飼養、生命周期短、對外界環境污染物暴露敏感等特點，被廣泛用于水體污染物致毒機理和污染監測的靶標生物[8]?；ǔ釗u蚊(Chironomuskiinensis)隸屬于雙翅目(Diptera)搖蚊科(Tendipedidea)，為完全變態昆蟲，是搖蚊中的優勢種。國內外對紅裸須搖蚊(Propsilocerusakamusi)生物標記物的研究報道較多，而有關花翅搖蚊生物標記物以及解毒酶系的研究鮮有報道。筆者以花翅搖蚊為對象，在測定了對氯苯酚和對苯二胺對搖蚊幼蟲急性毒性基礎上進一步研究了2種取代苯對細胞色素P450酶活性的影響，旨在探討細胞色素P450作為監測取代苯污染物的生物化學標志物的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1供試昆蟲。花翅搖蚊初始種群來源于中國農業大學昆蟲生理與毒理實驗室，在室內用暴曬除氯3 d以上的自來水進行飼養，每7 d換一次水和投喂1～3 g金魚幼蟲飼料(產品成分：進口魚粉、南極蝦粉、植物蛋白、維生素、礦物質以及氨基酸)，采用50目紗網罩住以防止成蟲飛出，自然光照飼養。挑選健壯、顏色、大小一致的4齡幼蟲用于試驗。

1.1.2主要試劑?？捡R斯亮藍G-250、牛血清白蛋白(BSA)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、二硫蘇糖醇(DTT)、乙二胺四乙酸(EDTA)、丙基硫氧嘧啶(PTU)、還原性輔酶Ⅱ(NADPH)和二甲基亞砜(DMSO)均購自Sigma公司；磷酸二氫鈉、濃鹽酸、氯仿、乙醇、磷酸、氫氧化鈉均為分析純。對硝基苯甲醚、對硝基苯酚和對氯苯酚(含量99%)購自國藥集團化學試劑有限公司；對苯二胺(含量98.5%)購自天津光復精細化工研究所。

1.2 方法

1.2.1搖蚊急性毒性測定。采用藥液培養法。將對氯苯酚和對苯二胺用DMSO配制成10 000 mg/L母液，再用蒸餾水配成6～7個濃度梯度，以蒸餾水為空白對照，將供試搖蚊4齡幼蟲放入盛有50 ml藥液的透明塑料杯中，每處理20頭，每濃度3次重復，觀察搖蚊的中毒癥狀并及時挑出死亡個體，分別于6、12、24、48 和96 h統計死亡數，以探針觸動搖蚊尾部對機械刺激無反應者視為死亡。

1.2.2致毒處理。將對氯苯酚和對苯二胺用DMSO配制成10 000 mg/L母液，再用蒸餾水稀釋成1、10和100 μmol/L 的應用液。隨機挑取25頭健康、顏色、大小一致的花翅搖蚊4齡幼蟲放入50 ml應用液中，不含取代苯蒸餾水作為對照，每個濃度14個處理，處理24和72 h各更換一次藥液，分別于6、12、24、48、72、96 h隨機挑取40頭花翅搖蚊4齡幼蟲，濾紙吸收蟲體表面藥液后，液氮迅速冷凍，立即或放入-80 ℃冰箱內用于P450酶活性測定。

1.2.3細胞色素P450酶活性測定。取花翅搖蚊4齡幼蟲40頭置于5 ml玻璃勻漿器中，加入4 ml 0.1 mol/L磷酸緩沖液(含0.1 mmol/L DTT、1.0 mmol/L EDTA、1.0 mmol/L PTU、1.0 mmol/L PMSF, pH 7.5)，冰上研磨充分，6 907 r/min離心15 min，上清液即為原酶液。將1 ml原酶液、800 μl 0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.5)、100 μl 4.8 mmol/L NADPH、100 μl 20.0 mmol/L對硝基苯甲醚底物放入10 ml離心管中充分振蕩混勻，30 ℃水浴溫育30 min，加入40 μl濃鹽酸終止反應，再加入5 ml氯仿，劇烈振蕩20 min，靜置3～5 min，1 938 r/min、4 ℃離心15 min，吸取下層清液3 ml并轉移至10 ml離心管中，加入3 ml 0.5 mol/L 氫氧化鈉溶液，劇烈振蕩15 min，靜置5 min，吸取上層萃取液，于412 nm波長下測定生成對硝基苯酚OD值，空白對照組采用3 ml氫氧化鈉溶液，每個處理3次重復。測定不同濃度對硝基苯酚在412 nm波長下的OD值，根據OD值和對硝基苯酚含量制作標準曲線，根據標準曲線計算樣品體系中對硝基苯酚的含量。根據反應時間、對硝基苯酚的生成量和蛋白質含量計算細胞色素P450酶比活力。蛋白質含量的測定參照Bradford的考馬斯亮藍G-250法[9]。

1.2.4取代苯對離體細胞色素P450酶活性的抑制。將對氯苯酚配制成濃度為10、50、100、300、500 mg/L的溶液，對苯二胺配制成濃度為10、50、100、500、900、1 000 mg/L的溶液，以蒸餾水為對照組，每個處理隨機選取40頭花翅搖蚊4齡幼蟲用于細胞色素P450酶液制備。反應體系為1 ml原酶液、760 μl 0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.5)和40 μl不同濃度的對氯苯酚或對苯二胺溶液，充分混勻，30 ℃水浴5 min，再加入100 μl 4.8 mmol/L NADPH、100 μl 20.0 mmol/L對硝基苯甲醚，充分混勻后迅速放入30 ℃溫浴25 min，每個濃度3次重復，其余測定方法同“1.2.3”。

1.3 數據處理采用POLO軟件計算取代苯對搖蚊幼蟲的LC50及95%置信區間。運用GraphPad InStat軟件對同一時間不同濃度間差異采用Tukey檢驗進行比較分析(P=0.05)。酶活性抑制率=(對照活性-殘留活性)/對照活性×100%。以取代苯濃度的對數值(LogM)和酶活性抑制率(%)得出濃度對數-抑制率線性回歸方程，根據方程求出抑制率為50%的取代苯濃度，即為IC50。

2 結果與分析

2.1 對氯苯酚和對苯二胺對花翅搖蚊幼蟲的毒性對氯苯酚和對苯二胺對花翅搖蚊4齡幼蟲半數致死濃度隨著作用時間的延長而減小，24 h半數致死濃度分別為38.65和78.43 mg/L，表明對氯苯酚對花翅搖蚊毒性大于對苯二胺(表1)。

表1 對氯苯酚和對苯二胺對花翅搖蚊4齡幼蟲的急性毒性

取代苯處理時間hLC50(95%置信區間)mg/L斜率χ2(自由度)對氯苯酚671．09(61．80～82．49)4．02±0．4812．21(16)1257．60(50．30～64．78)6．97±1．173．83(16)2438．65(31．07～44．30)6．18±1．294．67(13)4819．92(15．95～23．56)6．60±1．428．24(13)9611．49(10．28～12．63)5．92±1．008．99(19)對苯二胺6316．39(260．00～374．51)4．60±0．918．35(16)1297．82(77．44～118．15)3．93±0．5812．63(18)2478．43(58．08～94．56)5．68±1．404．66(16)4838．78(27．69～47．04)7．32±1．931．37(16)9618．12(15．04～20．29)5．69±1．3311．96(22)

2.2 對氯苯酚和對苯二胺對花翅搖蚊幼蟲細胞色素P450酶體內活性的影響從圖1可知，對氯苯酚處理花翅搖蚊4齡幼蟲6 h，10和100 μmol/L處理組體內P450酶活性均低于對照，分別為對照組的0.67和0.38倍，表現為顯著抑制作用(P<0.05)。暴露12和24 h，搖蚊體內P450酶活性變化相似，均低于對照組，最大抑制率分別為40.88%和70.68%。然而，處理72 h，搖蚊體內P450酶活性均顯著高于對照(P<0.05)，表現為誘導增強；其中100 μmol/L對氯苯酚最大誘導率為54.01%。暴露96 h，搖蚊體內P450酶活性隨濃度增加而降低，100 μmol/L對氯苯酚對P450酶活性抑制率為32.43%。對氯苯酚對花翅搖蚊幼蟲體內P450酶活性的影響主要表現為隨著作用時間的增加而抑制作用減小。

由圖2可知，與對照組相比，暴露對苯二胺6～24 h，搖蚊體內P450酶活性均顯著低于對照，表現為顯著抑制作用(P<0.05)，最大抑制率分別為64.94%、62.31%和55.88%。暴露48 h，1和10 μmol/L處理組P450酶活性顯著低于對照組(P<0.05)，而100 μmol/L處理組P450酶活性高于對照，表現為誘導作用，誘導率為15.80%。暴露72和96 h，搖蚊體內P450酶活性變化相似，表現為低濃度抑制高濃度誘導作用，其中100 μmol/L對苯二胺誘導率分別為59.47%和29.12%。對苯二胺對搖蚊體內P450酶活性的影響主要表現為隨著作用濃度和時間的增加誘導作用增強。

2.3 對氯苯酚和對苯二胺對花翅搖蚊幼蟲細胞色素P450酶離體活性的影響由表2可知，對氯苯酚和對苯二胺對花翅搖蚊4齡幼蟲P450酶離體活性均有抑制作用，且隨濃度的增加而增大。對氯苯酚對P450酶活性半數抑制濃度為466.15 mg/L，而對苯二胺對P450酶活性半數抑制濃度為594.43 mg/L，表明離體P450酶對對氯苯酚敏感性高于對苯二胺。

表2 對氯苯酚和對苯二胺對花翅搖蚊4齡幼蟲P450酶半數抑制濃度

取代苯半數抑制濃度mg/L方程相關系數對氯苯酚466．15y=12．58x+16．400．95對苯二胺594．43y=21．18x-8．740．94

3 討論

具有苯環的芳香烴類取代物因其良好的化學穩定性和熱穩定性，不易被分解或生物降解，對水體的污染毒性大且具有“三致”效應和遺傳毒性，長期的沉積與污染會對人類健康與水生生物生長發育造成不可逆的危害[10]。環境污染物對水生生物毒性的評價一般以LC50作為評價依據。該研究結果表明，對氯苯酚和對苯二胺對花翅搖蚊4齡幼蟲96 h半數致死濃度分別為11.49和18.12 mg/L。根據《化學農藥環境安全評價試驗準則》[11]中對魚類的毒性等級劃分標準可知，對氯苯酚和對苯二胺對花翅搖蚊屬于低毒性的污染物。對苯二胺對泥鰍(Misgurnusangullicaudatus)LC50范圍為10～100 mg/L，根據有毒物質對魚類的急性毒性標準也屬于低毒[5]。苯環上的-H被不同取代基取代后表現出對生物的不同毒性差異，該研究表明6～96 h對氯苯酚的LC50均低于對苯二胺，其對氯苯酚對花翅搖蚊4齡幼蟲的急性毒性高于對苯二胺。大量研究也表明，苯酚、苯胺、氯苯和硝基苯對三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)的急性毒性大小為硝基苯>苯酚>氯苯>苯胺，基團毒性大小為-NO2>-OH>-Cl>-NH2[12]。取代苯化合物對發光菌的急性毒性研究也表明不同取代基間的化合物毒性大小為對二氯苯>對苯二胺，基團毒性大小為-Cl>-NH2[13]；同樣，6種取代芳烴化合物對發光菌的急性毒性大小為氯苯>對苯二胺>苯酚[14]，由此可見，對二氯苯與氯苯對生物的急性毒性均高于對苯二胺，當芳香族化合物氯苯引入-OH后形成氯酚類化合物，使其極性增強，易與蛋白質中的堿基作用, 表現出較強的親和力, 從而提高其毒性[15]。同時，由于氯酚中含有-OH會與受體靶分子發生相互作用, 還可以通過氫鍵結合增加與細胞的脂溶性而增強其毒性，這與該研究結果“對氯苯酚毒性大于對苯二胺”相一致[12]。從元素的電負性角度分析，O、Cl、N電負性大小為O>Cl>N，O、Cl、N隨電負性的減小，其得到電子的能力逐漸減弱，與生物分子間的作用力也逐漸變弱[16]，而除H元素外，對氯苯酚的取代基含有O和Cl元素，而對苯二胺取代基僅含N元素，從基團的電負性比較，-OH的電負性也要高于-NH2[17]。對氯苯酚毒性高于對苯二胺與元素和基團電負性的大小呈現相一致的結果。

LC50常作為最可信的毒性效應指標，而環境有機污染物對水生生物體內生物標志物系統也產生不同致毒效應。生物標志物能夠對1種或多種化學污染物的暴露效應的生化、細胞、生理、行為以及能量上的變化[18]，是衡量環境污染物的暴露及效應的生物反應。P450s酶系屬于混合功能氧化酶(MFO)的一種，已作為環境中公認的生物標志物，對多環芳烴(PAHs)、多氯聯苯(PCBs)等有機污染物極敏感，可通過水體水生生物P450酶來監測這些有機污染物的污染狀況[19]。其中，魚肝細胞色素 P4501A1(CYP1A1)作為有機污染物的生物標志物已經大量應用于野外現場研究[20]。P450酶系作為良好的生物標志物，一是外源化合物可以誘導或抑制P450酶活性表達[21]，可通過P450酶的表達量得到監控，同時，其良好的解毒性可將脂溶性有機異生物質轉化為水溶性的易被生物排泄的代謝產物，包含生物轉化酶和解毒酶，幾乎存在于生物體所有組織中[22]。P450酶還可通過電子傳遞機制和羥基化、環氧化、脫烷基化、脫氯化等過程生物催化不同類型外源物質代謝過程，從而實現對污染物的生物降解[23]。目前，研究表明P450酶系中的亞酶CYP1A1，在二惡英(TCDD)濃度為50.0 nmol/L以上，處理48、72 h的誘導下，CYP1A1的表達上調，存在相應的時間與劑量關系[24]，CYP1A1可作為TCDD污染物的檢測性物質；黑斑蛙(Rananigromaculata)暴露于Cd溶液30 d，其精巢組織細胞色素P450亞族酶乙氧基異酚惡唑脫乙基酶(EROD)活性在0.5和1.0 mg/L Cd 處理組被顯著抑制，對低濃度的Cd溶液較敏感[25]。艾國民等利用高效液相色譜法測定家蠅吡蟲啉抗性和敏感品系體內細胞色素P450 O-脫甲基活性，發現抗性品系家蠅的P450 O-脫甲基活性為敏感品系的3.34倍[26]。該研究通過分光光度計法測定細胞色素P450 O-脫甲基活性，結果表明P450酶活性對對氯苯酚與對苯二胺響應存在相應時間與劑量效應。取代苯對氯苯酚和對苯二胺對花翅搖蚊4齡幼蟲體內P450酶活性的影響主要表現為抑制作用，96 h作用時間內最大抑制率分別為70.68%和64.94%，而對離體P450酶活性的IC50分別為466.15和594.43 mg/L，均高于LC50。雖然離體P450IC50可以表明花翅搖蚊幼蟲對對氯苯酚敏感性高于對苯二胺，但從作為指示性指標來說，水體中對氯苯酚與對苯二胺的濃度遠小于LC50，采用搖蚊急性毒性處理的LC50比離體P450酶活性的LC50更為適合?？傊?，對氯苯酚與對苯二胺對花翅搖蚊4齡幼蟲均具有一定的毒性效應，且隨著處理時間的延長，花翅搖蚊幼蟲對對氯苯酚和對苯二胺的敏感性增大。此外，對氯苯酚和對苯二胺還影響花翅搖蚊體內和體外細胞色素P450酶活性，并隨著濃度和暴露時間的延長呈現劑量-時間效應，表明細胞色素P450酶參與了花翅搖蚊對對氯苯酚和對苯二胺的應答機制。然而，由于編碼細胞色素P450蛋白的基因是一個超級家族，可能由于不同亞家族基因對對氯苯酚和對苯二胺存在不同時間和濃度表達效應，最終導致P450酶活性呈現無顯著的差異規律性，因此，有關細胞色素P450家族基因表達與取代苯類有機污染物脅迫的相關性有待進一步研究。

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Toxicity of Two Substituted Benzenes and Their Effects on Cytochrome P450 Activity ofChironomuskiinensis

NIU Fang1, XIE Fei2, ZHANG Jian1, CAO Chuan-wang1*et al

(1. School of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin, Heilongjiang 150040; 2. Jiangxi Forest Pest Control and Quarantine Bureau, Nanchang, Jiangxi 330038)

[Objective] The aim was to evaluate the effects of substituted benzenes on the aquatic insect toxicity and the activities of cytochrome P450. [Method] The 4th instarC.kiinensislarvae were used to evaluate the toxicity of p-chlorophenol and p-phenylenediamine and the effects of them on the activities of cytochrome P450 using the method of liquid culture and in vivo and in vitro enzymatic activity assay, respectively. [Result] TheLC50value of p-chlorophenol and p-phenylenediamine to larvae after exposure for 24 h was 38.65 and 78.43 mg/L, respectively. The inhibition of P450 activities in the 4th instarC.kiinensislarvae gradually decreased with the increase of treatment time of p-chlorophenol while the induction of P450 activity increased with the increase of p-phenylenediamine concentration. The median inhibitory concentration (IC50) of the in vitro cytochrome P450 activity for p-chlorophenol and p-phenylenediamine were 466.15 and 594.43 mg/L, respectively. [Conclusion] The cytochrome P450 activity of theC.kiinensiscan be served as a biochemical marker to monitor the water pollution caused by the p-chlorophenol and p-phenylenediamine.

Chironomuskiinensis； P-chlorophenol； P-phenylenediamine； Cytochrome P450；Toxicity；Activity

中央高?；究蒲袠I務費專項(2572014CA10)；黑龍江省自然科學基金項目(C201409)；東北林業大學青年拔尖人才項目(PYTT-1213-10)。

牛芳(1989-)，女，吉林吉林人，碩士研究生，研究方向：昆蟲毒理學。*通訊作者，副教授，博士，碩士生導師，從事昆蟲毒理學研究。

2015-03-18

S 186

A

0517-6611(2015)12-113-04