篩選大葉蛇葡萄體外抗腫瘤活性物質

桂 春， 黃 靜， 程佩佩， 方 玉， 夏 葉， 張秀橋

（湖北中醫藥大學藥學院，湖北武漢430000）

篩選大葉蛇葡萄體外抗腫瘤活性物質

桂 春， 黃 靜， 程佩佩， 方 玉， 夏 葉， 張秀橋*

（湖北中醫藥大學藥學院，湖北武漢430000）

目的研究大葉蛇葡萄提取物對HeLa細胞增殖的影響，篩選有效抗腫瘤活性物質。方法采用MTT法檢測不同質量濃度的大葉蛇葡萄石油醚、乙酸乙酯及水層萃取物和蛇葡萄素、楊梅素、楊梅苷、槲皮素及槲皮苷分別作用于HeLa細胞24、48、72 h后對細胞增殖的抑制作用。流式細胞儀檢測蛇葡萄素對細胞周期的影響。結果乙酸乙酯萃取物、蛇葡萄素和楊梅素均有不同程度抑制HeLa細胞增殖的作用，且在一定劑量范圍內，具有時效或量效關系；碘化丙啶單染法顯示蛇葡萄素作用HeLa細胞12 h，G0/G1期細胞比率降低，S期細胞比率增加。結論乙酸乙酯提取物、蛇葡萄素和楊梅素對HeLa細胞增殖有明顯抑制作用，且蛇葡萄素可能通過阻滯HeLa細胞于S期而誘導細胞凋亡。

大葉蛇葡萄；蛇葡萄素；楊梅素；抗腫瘤；HeLa細胞；細胞增殖；細胞周期

大葉蛇葡萄Ampelopsismegalophylla Diels et. Gilg是葡萄科蛇葡萄屬植物，湖北西部地區民間常用中草藥。其藥用部位是葉及嫩莖，因其嫩枝葉置沸水中稍燙后，撈起后通風處吹干，表面會出現星點白霜，故又稱為霉茶［1］。該藥曾收載于 《湖北中草藥志》［2］，性平，味酸、澀，具有活血散瘀、止血、清熱解毒等功效。現代藥理學研究表明其具有降血脂、降血糖、降血壓、抗病毒等［3-7］作用，但未見其對抗腫瘤作用的研究報道。

本實驗采用MTT［8-10］法觀察大葉蛇葡萄3種不同提取物對HeLa細胞增殖抑制情況，分析不同提取物對腫瘤細胞的影響。實驗結果提示乙酸乙酯萃取物對HeLa細胞的增殖有較好的抑制作用，進而將從乙酸乙酯萃取物分離得到的蛇葡萄素等5種化合物分別采用MTT法觀察其對HeLa細胞的抑制作用，并將抑制作用最強的蛇葡萄素進行細胞周期分布的研究，初步探討其作用機制。

1 材料

1.1 材料

1.1.1 藥品和細胞株 大葉蛇葡萄采于湖北省恩施州來鳳縣，經湖北中醫藥大學生藥學教研室張秀橋教授鑒定為葡萄科蛇葡萄屬植物大葉蛇葡萄Ampelopsismegalophylla Diels et.Gilg，取其葉及嫩莖為實驗材料。實驗所用宮頸癌細胞HeLa購于中國典型培養物保藏中心，在武漢大學藥學院細胞室傳代備用。

1.1.2 試劑 四甲基偶氮唑鹽粉末（MTT，美國Amresco公司），DMEM培養基、磷酸鹽緩沖液（PBS）、青霉素-鏈霉素 （雙抗）、胰蛋白酶 （美國Thermo公司），小牛血清 （NBS，杭州四季青生物工程材料有限公司），二甲基亞砜 （DMSO）、碘化丙啶（propidium iodide，PI）粉末（美國Sigma公司）。

1.1.3 大葉蛇葡萄提取物的分離與溶液制備 稱取大葉蛇葡萄藥材8.5 kg，粉碎，過10目篩，分別以10倍量95%和75%乙醇各滲漉提取一次 （浸泡24 h，體積流量10 mL/min），合并提取液，減壓回收乙醇并濃縮至小體積得乙醇提取物；加適量水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯和水進行萃取，分別合并3種不同萃取液，最后依次濃縮干燥得到石油醚、乙酸乙酯及水層提取物。取乙酸乙酯提取物200 g采用硅膠柱、Sephadex LH-20柱色譜等技術分離純化，分別得到蛇葡萄素、楊梅素、楊梅苷、槲皮素和槲皮苷。稱取適量的提取物，用DMSO配成適當濃度的供試液，4℃冰箱保存，實驗時用培養基稀釋成所需藥物濃度，提取物質量濃度分別為12.5、25、50、100、200μg/mL，單體的摩爾濃度為20、40、80、160、320μmol/L。

1.1.4 實驗儀器 Galaxy s+CO2培養箱（英國RSBiotech公司）；ClassⅡtype A2超凈工作臺（北京東聯哈爾儀器制造有限公司）；IX51Olympus倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；HEV-50自動高壓滅菌器（日本Hirayama公司）；iMark酶標儀（美國Bio-RAD公司）；TDZ4-WS臺式自動平衡離心機 （長沙平凡儀器儀表有限公司）；流式細胞儀（美國BD公司）；BCD-188C冰箱（合肥美菱股份有限公司）；WG-136電熱鼓風干燥箱 （天津市泰斯特儀器有限公司）。

2 實驗部分

2.1 細胞培養 HeLa細胞采用DMEM培養基，在37℃、5%CO2培養箱中培養，細胞呈貼壁生長，用0.25%的胰酶消化傳代，用于實驗的細胞均處于對數生長期。

2.2 MTT法測定HeLa細胞的生長抑制率 選擇處于對數生長期的細胞，0.25%胰蛋白酶消化后，調整細胞計數為5×103個/mL接種于96孔板，每孔100μL，然后將培養板置37℃、5%CO2培養箱中24 h后，吸取舊培養液，每孔加入100μL的藥液，每個濃度設置3個復孔，并設置空白對照組（含細胞、培養基及溶劑）和調零組 （含培養基和溶劑）。分別在培養箱溫孵24、48、72 h后，每孔加入20μLMTT溶液，繼續放入37℃、5%CO2培養箱培養。4 h后吸去上清液，加入100μL的DMSO，放置于搖床上低速振蕩至每孔中結晶物完全溶解。在酶標儀490 nm波長處測量各孔吸光度（OD）。實驗重復3遍。

2.3 PI單染法檢測HeLa細胞周期 選擇對數生長期的細胞，0.25%胰蛋白酶消化后，調整細胞計數為2×105個/mL接種于6孔板，每孔2 mL。培養24 h后，分別加入 0、30、40、50、60、70 μmol/L的蛇葡萄素藥液，12 h后收集細胞。離心后用預冷的PBS洗滌2次后，加入75%乙醇放置-20℃環境固定過夜，離心后PBS洗滌2次，加入30μL 1 mg/mL RnaseA，37℃作用30 min，加入50μg/m L的PI溶液，4℃避光染色30 min用流式細胞儀檢測，細胞周期擬和軟件分析結果［11-13］。

2.4 統計學分析 采用SPSS 17.0統計軟件進行分析，結果用x±s表示，與對照組比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義，同時計算半數抑制率 （IC50）值。

3 結果及分析

3.1 提取物對HeLa細胞的生長抑制作用 一定濃度范圍內，3種提取物分別作用于HeLa細胞24、48和72 h。結果顯示當藥物作用時間為48 h時，在25～200μg/mL范圍內，石油醚提取物對HeLa細胞的抑制作用隨質量濃度的升高而增強，表現劑量依賴性；當藥物作用時間為72 h時，在12.5～200μg/mL范圍內，石油醚提取物對HeLa細胞的抑制作用隨質量濃度的升高而增強，表現劑量依賴性。如圖1A所示。當藥物作用時間為48 h時，在12.5～200μg/mL范圍內，乙酸乙酯提取物對HeLa細胞的抑制作用隨質量濃度的升高而增強，表現劑量依賴性；當藥物質量濃度為50μg/mL時，乙酸乙酯提取物對HeLa細胞的作用隨時間的延長而減弱，表現時間依賴性，即當藥物作用時間為24 h，抑制作用最強。結果見圖1B。HeLa細胞對水層提取物不敏感，結果見圖1C。

圖1 石油醚、乙酸乙酯、水層提取物對HeLa細胞抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of ether,EtOAc,aqueous extract on cell proliferation in HeLa

3.2 單體化合物對HeLa細胞的生長抑制作用

一定濃度范圍內，5種化合物分別作用于HeLa細胞24、48和72 h后，對細胞增殖的抑制作用結果如圖2～6所示。

圖2 蛇葡萄素對HeLa細胞抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of am pelopsin on cell proliferation in HeLa

圖3 楊梅素對HeLa細胞抑制作用Fig.3 Inhibitory effect ofm yricetin on cell proliferation in HeLa

圖4 楊梅苷對HeLa細胞抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of m yricetrin on cell proliferation in HeLa

圖5 槲皮素對HeLa細胞抑制作用Fig.5 Inhibitory effect of quercetin on cell p roliferation in HeLa

圖6 槲皮苷對HeLa細胞抑制作用Fig.6 Inhibitory effect of quercetrin on cell proliferation in HeLa

當藥物作用48 h，在20～320μmol/L范圍內，蛇葡萄素對細胞的抑制作用隨濃度的升高而增強，表現劑量依賴性；當藥物作用72 h，在40～320μmol/L范圍內，蛇葡萄素對細胞的抑制作用隨劑量的升高而增強，表現劑量依賴性；當藥物濃度分別為80、160和320μmol/L時，蛇葡萄素對He-La細胞增殖的抑制作用均隨時間的延長而增強，分別表現時間依賴性；即當藥物作用時間為72 h時，蛇葡萄素對HeLa細胞增殖的抑制作用最強，如圖2所示。經計算得蛇葡萄素作用HeLa細胞24、48和72 h的 IC50分別為105.30、90.55和65.58μmol/L。

當藥物作用48 h，在40～320μmol/L范圍內，楊梅素對HeLa細胞的抑制作用隨濃度的升高而增強，表現劑量依賴性；當藥物濃度分別為80、160和320μmol/L時，楊梅素對HeLa細胞增殖的抑制作用均隨時間的延長而增強，表現時間依賴性；即當藥物作用時間為72 h時，楊梅素對HeLa細胞增殖的抑制作用最強，如圖3所示。計算得楊梅素作用HeLa細胞24、48和72 h的IC50分別為108.15、93.06和85.44μmol/L。

由圖4可知，當藥物作用48或72 h，在20～160μmol/L范圍內，楊梅苷對HeLa細胞幾乎無抑制作用，當藥物劑量逐漸升高至320μmol/L過程呈現一定的抑制作用。

當藥物作用24或48 h，在40～320μmol/L范圍內，槲皮素對細胞的抑制作用隨濃度的增高而增強，表現劑量依賴性；當藥物作用72 h，在20～320μmol/L范圍內，槲皮素對細胞的抑制作用隨濃度量的增高而增強，表現時間依賴性；如圖5所示。經計算得槲皮素作用HeLa細胞48和72 h的IC50分別為229.38和158.9μmol/L。

由圖6可知，HeLa細胞對槲皮苷不敏感。

3.3 蛇葡萄素對HeLa細胞周期分布的影響 流式細胞儀檢測不同濃度的蛇葡萄素作用HeLa細胞的DNA水平揭示了HeLa細胞周期分布的變化。如圖7所示，與空白對照組對照可知，G0/G1期，給藥組的DNA水平隨著藥物劑量的升高逐漸降低；S期，給藥組的DNA水平呈現升高趨勢；G2/M期，在30～60μmol/L范圍內，給藥組DNA水平隨著藥物劑量的升高逐漸增大，當濃度為70μmol/L，DNA水平減小。由此可知，高濃度時細胞凋亡較多，蛇葡萄素可能造成HeLa細胞S期阻滯，從而影響細胞周期正常進行。

4 討論

宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一［14］，在全球女性腫瘤中發病率僅次于乳腺癌［15］，它的發病和死亡的85%以上是在發展中國家［16］。作為發展中國家，2010年我國宮頸癌病例 27 000～130 000例，若沒有進行任何干預措施，到2050年可能增加到42 000～187 000例［17］。由此可見，對宮頸癌的有效治療對女性健康的必要性和重要性。隨著現代社會的腫瘤患者的增多，西藥治療療效相對明顯，但伴隨毒副作用，且久用會產生耐藥性，而人們對身體的重視程度卻在不斷提高。我國中藥資源豐富，種類繁多，在治療腫瘤方面積累了寶貴的經驗，因此從中篩選出高效低毒的抗宮頸癌藥物具有廣闊前景。

本實驗針對此問題，選取宮勁癌HeLa細胞對大葉蛇葡萄的抗腫瘤活性進行了系列研究。根據圖1比較可知，水層提取物對HeLa細胞幾乎無抑制作用，其他兩種提取物在一定劑量、時間范圍內都表現相對的抑制作用。

當藥物作用時間為24 h時，在12.5～200 μg/mL范圍內，石油醚提取物對HeLa細胞無抑制作用，乙酸乙酯提取物對HeLa細胞抑制作用呈加強趨勢，且抑制作用較強；當藥物作用時間為48或72 h時，石油醚提取物對HeLa細胞抑制作用隨劑量的升高而加強，但只在最高劑量時抑制率達到半數抑制率，而乙酸乙酯提取物對HeLa細胞抑制作用隨劑量的升高而加強，且抑制作用最高達90.65%。

圖7 蛇葡萄素對HeLa細胞周期分布的影響Fig.7 Effect of ampelopsin on cell cycle distribution in HeLa

當藥物質量濃度為25μg/mL時，乙酸乙酯提取物對HeLa細胞作用24 h時的抑制作用明顯強于石油醚提取物，且抑制率為68.20%；當藥物質量濃度為50μg/m L時，乙酸乙酯提取物對HeLa細胞作用24 h的抑制作用亦明顯高于石油醚提取物，抑制率為73.64%；由此可見，3種提取物中，乙酸乙酯提取物對HeLa細胞的抑制作用最強，且通過計算最強IC50為28.55μg/mL。

根據圖7可知，HeLa細胞對槲皮苷不敏感，楊梅苷與槲皮素在高濃度時表現一定的抑制作用，相比較可知蛇葡萄素與楊梅素對HeLa細胞的抑制作用較強，且在一定的劑量、時間范圍內呈現時間-劑量效應關系。

當藥物作用時間為72 h，蛇葡萄素和楊梅素均得到最低IC50值，分別為65.58和85.44μmol/L。當藥物濃度為40μmol/L時，蛇葡萄素對HeLa細胞的抑制率為20.96%，而楊梅素對HeLa細胞生長表現促進作用；當藥物濃度為80μmol/L時，蛇葡萄素和楊梅素對HeLa細胞的抑制率分別為84.53和61.15%，前者抑制作用強于后者；當藥物濃度繼續升高，此兩種藥物對HeLa細胞生長的抑制作用變化不明顯。由此可見，5種化合物中，蛇葡萄素對HeLa細胞的抑制作用最強，且通過計算最強的IC50為65.58μmol/L。

本研究中首先對大葉蛇葡萄的3種提取物進行抗宮頸癌的活性篩選，發現乙酸乙酯提取物具有較強的抑制作用，且在一定劑量、時間范圍內，有良好的時間-劑量效應關系。進一步對從乙酸乙酯提取物分離得到的五種單體同樣進行了抗宮頸癌活性篩選，發現蛇葡萄素與楊梅素對HeLa細胞增殖有較強的抑制作用，最小IC50分別為65.58和85.44 μmol/L，因蛇葡萄素作為大葉蛇葡萄含有量最高的主要活性成分，且對HeLa細胞的IC50小于楊梅素，故選取蛇葡萄素作為代表物質進行下一步的細胞周期實驗表明，結果表明蛇葡萄素可能通過阻滯HeLa細胞于S期而誘導其凋亡，該研究為后期大葉蛇葡萄抗腫瘤作用機制的研究奠定了基礎，同時也為研制抗宮頸癌現代新藥提供了新方向。

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Screen of anti-tumor active substances in vitro from Ampelopsismegalophylla

GUIChun， HUANG Jing， CHENG Pei-pei， FANG Yu， XIA Ye， ZHANG Xiu-qiao*
（School of Pharmaceutical Sciences，Hubei University of Chinese Medicine，Wuhan 430065，PR China）

AIMTo investigate the inhibitory effect of extracts from Ampelopsismegalophylla on the proliferation of HeLa cells and to screen the anti-tumor activity in vitro.METHODSHeLa cellswere treated with ether，EtOAc and aqueous extracts of A.megalophylla as well as five compounds，ampelopsin，myricetin，myricetrin，quercetin and quercetrin，with various concentrations，respectively.MTTmethod was used to evaluate the inhibitory efficiency in 24 h，48 h and 72 h，respectively.Flow cytometry PIwas used tomeasure their changes of cell cycle under the condition of ampelopsin.RESULTSExperimental data showed EtOAc extract，ampelopsin and myricetin all inhibited the cell proliferation in a dose-effector time-effect relationship within a certain concentration range.Propidium iodide（PI）stainingmethod indicated that there were less cells at G0/G1stage andmore cells arrested at S stagewhen incubated with ampelopsin.CONCLUSIONEtOAc extract of A.megalophylla，ampelopsin andmyricetin can inhibit the human cervical cancer cell line HeLa in vitro by inhibiting cellproliferation.Maybe ampelopsin induces cell apoptosis by arresting cells at Sphase.

Ampelopsismegalophylla；ampelopsin；myricetin；anti-tumor；HeLa cells；cell proliferation；cell cycle

R285.5

：A

：1001-1528（2015）07-1411-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.005

2014-08-18

國家自然科學基金項目 （31170335）；武漢市重點科技攻關計劃項目 （201160823265）

桂 春 （1989—），女，碩士，從事中藥資源、品質及開發研究。Tel：15927207749，E-mail：gc19890703@163.com

*通信作者：張秀橋 （1965—），女，博士，教授，博士生導師，從事中藥資源、品質及開發研究。Tel：13871392318，E-mail：qiaoxzh2000@163.com