RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定復(fù)方雙花口服液中6種活性成分

徐 梅

（三門峽市中心醫(yī)院藥劑科，河南三門峽472000）

RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定復(fù)方雙花口服液中6種活性成分

徐 梅

（三門峽市中心醫(yī)院藥劑科，河南三門峽472000）

目的建立復(fù)方雙花口服液中原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、槲皮素、連翹苷和腺苷的定量分析方法。方法采用RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定復(fù)方雙花口服液中6種活性成分的含有量，Waters symmetry C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm），4%冰醋酸-乙腈梯度洗脫，體積流量為1.0mL/min，柱溫30℃，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為300 nm。結(jié)果在選定色譜條件下，原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、槲皮素、連翹苷和腺苷在0.079 8～0.478 8μg、0.533 0～3.198μg、0.091 4～0.548 4μg、0.104 0～0.623 7μg、0.138 8～0.802 8μg和0.084 4～0.506 4μg范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好 （r分別為0.999 0、0.999 0、0.999 3、0.999 5、0.999 4和0.999 9），平均回收率分別為99.6%、99.0%、98.1%、99.0%、98.0%和97.8%，RSD分別為1.2%、2.5%、1.6%、1.2%、1.2%和1.1%（n=9）。結(jié)論本方法色譜測(cè)定結(jié)果顯示，各待測(cè)物質(zhì)分離較好 （＞1.5），相互無(wú)干擾，重復(fù)性好，專屬性強(qiáng)，可用于復(fù)方雙花口服液的質(zhì)量控制。

復(fù)方雙花口服液；高效液相色譜法；原兒茶酸；綠原酸；咖啡酸；槲皮素；連翹苷；腺苷

復(fù)方雙花口服液是由金銀花、連翹、穿心蓮、板藍(lán)根組成的純中藥口服制劑，臨床上常用于清熱、解毒，治療急性扁桃體炎、上呼吸道感染和淋巴結(jié)炎等毒熱性疾病［1-2］。衛(wèi)生部標(biāo)準(zhǔn)中采用薄層掃描法對(duì)藥品中的綠原酸進(jìn)行了含量測(cè)定，方法較繁瑣［3］。查閱文獻(xiàn)，制劑中多種有效成分同時(shí)測(cè)定的相關(guān)研究較少。本實(shí)驗(yàn)采用RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定復(fù)方雙花口服液中原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、槲皮素、連翹苷和腺苷等6種有效成分的含有量，方法運(yùn)行時(shí)間較短，快速簡(jiǎn)便，且增加了測(cè)定成分，為更全面地評(píng)價(jià)此口服制劑的質(zhì)量提供參考。

1 儀器與試藥

Waters高效液相色譜儀系統(tǒng)（Waters2695 Separations Module，Waters 2996 Photodiode Array Detector Madein Singapore，美國(guó)Waters公司）；KH2200DB型超聲波清洗器 （昆山超聲儀器）；XS105型電子分析天平（瑞士梅特勒公司）。綠原酸對(duì)照品 （批號(hào)110753-201314）、原兒茶酸對(duì)照品 （批號(hào)110809-201205）、槲皮素對(duì)照品 （批號(hào)100081-201408）、連翹苷對(duì)照品 （批號(hào)110821-201213）、咖啡酸對(duì)照品 （批號(hào) 110885-200102）和腺苷對(duì)照品 （批號(hào)110879-200202）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈（色譜純，Grace Company INC）；娃哈哈純凈水；醋酸為分析純。復(fù)方雙花口服液購(gòu)自北京海爾富藥業(yè)有限公司 （批號(hào)分別為140406、140504、140505）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Waters symmetry C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），流動(dòng)相為4%冰醋酸（A）-乙腈 （B），線性梯度洗脫 （0～8 min，9%～19%A；8～15 min，19%～25%A；15～21 min，25%～90%A；31～40 min，90%A），體積流量為1.0 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為300 nm，柱溫30℃。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、槲皮素、連翹苷和腺苷對(duì)照品適量，甲醇稀釋并定容，制成質(zhì)量濃度分別為319.2、1 066、365.6、415.8、535.2、337.6μg/mL的單個(gè)對(duì)照品貯備液。精密量取各對(duì)照品貯備液置量瓶中，甲醇稀釋并定容，制成混合對(duì)照品溶液，質(zhì)量濃度分別為：原兒茶酸15.96μg/mL，綠原酸106.60μg/mL，咖啡酸18.28μg/mL，槲皮素20.79μg/mL，連翹苷26.76μg/mL和腺苷16.88 μg/mL，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密量取本品1 mL置于10 mL離心管中，加入5 mL甲醇，震蕩混合10 min，冰箱靜置3 h，3 000 r/min離心20 min，取上清液。沉淀由2 m L甲醇洗滌并離心取上清，重復(fù)2次，收集3次上清液于10 mL量瓶，甲醇定容并搖勻。微孔濾膜 （0.22μm）濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按復(fù)方雙花口服液處方及制劑工藝，制成缺金銀花、缺連翹和缺板藍(lán)根的陰性樣品，按 “2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法處理得陰性樣品溶液，即得。

2.3 專屬性試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液、陰性供試品溶液及供試品溶液10μL，分別注入高效液相色譜儀，按照 “2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)。記錄色譜圖，結(jié)果顯示6種有效成分吸收峰分離良好，對(duì)應(yīng)保留時(shí)間處無(wú)其他吸收峰，表明陰性無(wú)干擾，見(jiàn)圖1。

圖1 復(fù)方雙花口服液HPLC色譜圖Fig.1 HPLC Chromatograms of Com pound Shuanghua Oral Solution

2.4 線性關(guān)系的考察 精密吸取混合對(duì)照品溶液5、10、15、20、30μL對(duì)照品溶液，按照 “2.1”項(xiàng)下色譜條件，以色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍。結(jié)果表明6種有效成分在檢測(cè)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見(jiàn)表1。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取新制備的同一供試品溶液 （批號(hào)140504），于0、2、4、6、8、10、12進(jìn)樣20μL進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算RSD值。結(jié)果顯示，原兒茶酸，綠原酸，咖啡酸，槲皮素，連翹苷和腺苷的含有量分別為146.44、1 114.81、132.17、149.44、192.44、177.05μg/mL，RSD分別為1.1%、0.88%、1.8%、2.8%、2.8%和1.8%，結(jié)果表明樣品穩(wěn)定性較好。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍Tab.1 Standard cu rves and linear ranges of active substances

2.6 精密度 取同一批復(fù)方雙花口服液，按照“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液方法進(jìn)行制備，重復(fù)進(jìn)樣6次進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、槲皮素、連翹苷和腺苷平均含有量分別為143.75、1 109.22、131.34、152.74、190.56、181.82 μg/mL，RSD分別為0.82%、1.3%、1.4%、1.5%、2.0%和2.0%，結(jié)果表明精密度良好，符合定量分析要求。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批復(fù)方雙花口服液5份，按照 “2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液并進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示原兒茶酸，綠原酸，咖啡酸，槲皮素，連翹苷和腺苷平均含有量分別為 143.46、1 107.53、 129.48、 157.75、 190.94、 184.04 μg/mL，RSD分別為0.85%、1.4%、1.2%、2.7%、1.7%和2.5%。結(jié)果表明重復(fù)性良好，符合定量分析要求。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已測(cè)得各成分含有量的復(fù)方雙花口服液樣品9份各0.5 mL，按照0.5 mL樣品中成分含有量的80%、100%、120%分別精密加入各對(duì)照品貯備液，各3份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液并進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.9 樣品測(cè)定 取3批復(fù)方雙花口服液 （批號(hào)分別為140406、140504、140505），每批各3份，按照 “2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，注入高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品測(cè)定結(jié)果(μg/m L,n=3)Tab.3 Test results of sam p les(μg/m L,n=3)

3 討論

復(fù)方雙花口服液由金銀花、連翹、板藍(lán)根和陳皮組成，是一種在臨床推廣已久治療毒熱性疾病的中藥制劑。藥品生產(chǎn)過(guò)程復(fù)雜，成分較多，為有效控制其質(zhì)量穩(wěn)定性，合理準(zhǔn)確的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)是必須的［4］。

衛(wèi)生部標(biāo)準(zhǔn)中采用薄層掃描法對(duì)藥品中的綠原酸進(jìn)行了定量測(cè)定，口服液中的單一有效成分綠原酸或連翹苷的定量測(cè)定方法已有相關(guān)報(bào)道［5-6］，但對(duì)制劑中多種有效成分同時(shí)測(cè)定尚未見(jiàn)到。本實(shí)驗(yàn)參考相關(guān)文獻(xiàn)，采用RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定復(fù)方雙花口服液中原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、槲皮素、連翹苷和腺苷6種有效成分［7-10］，測(cè)量品種較多，運(yùn)行時(shí)間不超過(guò)40 min，方法快速簡(jiǎn)便，比現(xiàn)有文獻(xiàn)檢測(cè)成分多，效率高。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of recovery tests

中藥制劑成分復(fù)雜，雜質(zhì)較多，本實(shí)驗(yàn)在乙腈-4%醋酸流動(dòng)相系統(tǒng)中進(jìn)行線性梯度洗脫，色譜測(cè)定結(jié)果顯示，各待測(cè)物質(zhì)分離較好 （＞1.5），相互無(wú)干擾［11-13］。原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、槲皮素、連翹苷和腺苷6種有效成分性質(zhì)不同，紫外條件下有最大吸收波長(zhǎng)分別為260 nm、327 nm、323 nm、340 nm、277 nm和260 nm，全波長(zhǎng)掃描結(jié)果比較顯示，在檢測(cè)波長(zhǎng)為300 nm時(shí)各成分峰形較好且雜質(zhì)峰較少［14-16］。在進(jìn)行供試品處理時(shí)，比較了乙腈、甲醇、80%甲醇的3種溶劑系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)選用甲醇進(jìn)行處理時(shí)，色譜圖溶劑峰較小，雜質(zhì)沉淀完全，回收率試驗(yàn)結(jié)果表明回收率均高于95%，表明該處理方法可有效除雜且回收率良好。在相應(yīng)方法學(xué)考察中，儀器精密度良好，重復(fù)進(jìn)樣，各有效物質(zhì)的RSD值均小于3.0%。在穩(wěn)定性考察中發(fā)現(xiàn)，24 h內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣，各有效成分含有量變化較小，測(cè)定重復(fù)性好，表明本方法穩(wěn)定準(zhǔn)確。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)采用RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定復(fù)方雙花口服液中6種有效成分的含有量并進(jìn)行了相應(yīng)的方法學(xué)考察，結(jié)果顯示方法靈敏簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，且有較高的準(zhǔn)確性，可為復(fù)方雙花口服液質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)。

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Determ ination of six constituents in Compound Shuanghua Oral Solution by RPHPLC

XU Mei
（Sanmenxia Central Hospital，Sanmenxia 472000，China）

AIMTo establish a fast and sensitivemethod for simultaneously determining six constituents，including protocatechuic acid，chlorogenic acid，caffeic acid，meletin，phillyrin and adenosine in Compound Shuanghua Oral Solution.METHODSRP-HPLC analysis of six active constituents was performed on Waters symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5μm）column in a gradient elution manner with 4%acetic-acid-acetonitrile asmobile phase.The flow ratewas1.0 mL/min.The column temperature wasmaintained at30℃.And the detection wavelength was set at300 nm.RESULTSThe linear relationship of the six active constituentswerewithin the range of 0.0798-0.478 8μg，0.533 0-3.198μg，0.091 4-0.548 4μg，0.104 0-0.623 7μg，0.138 8-0.802 8 μg，and 0.084 4-0.506 4μg，with r were 0.999 0，0.999 0，0.999 3，0.999 5，0.999 4 and 0.999 9，respectively.The average recoveries were 99.6%（RSD=1.2%），99.0%（RSD=2.5%），98.1%（RSD= 1.6%），98.9%（RSD=1.2%），98.0%（RSD=1.2%），and 97.8%（RSD=1.1%），respectively.CONCLUSIONThemethod is feasible，precise and reproducible.It can be used for the quality control ofCompound Shuanghua Oral Solution.

Compound Shuanghua Oral Solution；HPLC；protocatechuic acid；chlorogenic acid；caffeic acid；meletin；phillyrin；adenosine

R927.2

：A

：1001-1528（2015）07-1482-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.019

2014-11-19

徐 梅（1973—），女，主管藥師，從事醫(yī)院藥學(xué)研究。Tel：13273988116，E-mail：meixu186@126.com