炮制對蒺藜皂苷類成分的影響

李瑞海， 馮 琳， 馬欣悅， 劉書平， 孫延君， 賈天柱（遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧大連116600）

[飲片炮制]

炮制對蒺藜皂苷類成分的影響

李瑞海， 馮 琳， 馬欣悅， 劉書平， 孫延君， 賈天柱（遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧大連116600）

目的測定炮制前后蒺藜的皂苷成分含有量并推測其炮制機理。方法蒺藜甲醇提取液的正丁醇部位的HPLC分析采用Ultimate LP-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流動相為甲醇-水（80∶20），檢測波長203 nm；采用高氯酸作顯色劑，蒺藜皂苷元為指標，測定蒺藜總皂苷。結果蒺藜皂苷元在0.82～7.38μg和24.6～86.1μg有良好的線性關系，平均回收率分別為99.3%和100.7%。蒺藜經清炒法、烘制法炮制后，其總皂苷含有量下降，皂苷元含有量增加。結論實驗結果表明，蒺藜烘制與清炒作用相同，其機理可能為其皂苷經炒制轉化為結構性質更為穩定的蒺藜皂苷元成分。

蒺藜；炒制；烘制；蒺藜皂苷元；比色法；炮制機理

蒺藜為蒺藜科蒺藜Tribulus terrestris L.的干燥成熟果實。具有平肝解郁、活血祛風、明目、止癢之功效［1］，臨床常用于頭痛眩暈、胸脅脹痛、乳閉乳癰、目赤翳障、風疹瘙癢［2］。其性味辛、苦，微溫；有小毒。歸肝經。有報道蒺藜的嫩莖鮮品被馬、羊等動物食后會引起中毒，但曬干后可作為藥物使用，而且經炮制后應用于臨床［3-4］，提示蒺藜經一定方法處理后可能存在 “減毒增效”的作用，目前尚無相關報道。經查閱文獻和歷版 《中國藥典》發現，蒺藜多為火制。蒺藜火制方法始于唐代，有 “燒”、“炒焦”、“炒 （杵）去刺”、“熬”等。宋代火制方法有 “微炒”、 “熬令黃”等，酒制方法有 “酒蒸”、“酒炒”。《中國藥典》2010年版規定蒺藜炮制為 “炒蒺藜，取凈蒺藜，照清炒法 （附錄ⅡB）炒至微黃色”［5-7］。本研究擬采用傳統 “炒法”，對蒺藜進行炮制。又因為 “炒”制的過程主要的影響因素是溫度的高低和作用時間長短的不同，因此本研究擬采用烘箱烘制蒺藜輔助說明“炒”制的作用。參考已發表文獻 ［8-14］，本研究擬采用傳統 “炒”法和烘制法，并利用HPLC法、比色法，對蒺藜成分在炮制前后的變化進行對比研究，初步說明 “炒”制蒺藜的炮制機理。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Agilent 1100 Series高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司），安捷倫色譜工作站；U-3010紫外分光光度計 （日本日立公司）UV Solutions 2.1工作站，十萬分之一電子天平 （德國賽多利斯公司）。

1.2 試藥 蒺藜皂苷元TTS對照品 （25R-spirostan-4-ene-3，12-dione）（本實驗室分離純化，純度＞98%）；高效液相色譜用水為蒸餾水，甲醇為色譜純；其他試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 蒺藜皂苷元HPLC測定

2.1.1 色譜條件 Welch Ultimate LP-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相為甲醇-水（80∶20），體積流量1.0 mL/min；檢測波長203 nm；柱溫30℃［8-9］。

2.1.2 供試品溶液制備 取蒺藜藥材，粉碎，精密稱取1 g，加甲醇10 m L，加熱回流處理3次，每次1 h。過濾，合并濾液，蒸干。加甲醇轉移并定容至10 mL量瓶中，經0.45μm微孔濾膜過濾，備用。

2.1.3 對照品溶液制備 精密稱定蒺藜皂苷元（25R-spirostan-4-ene-3，12-dione）對照品適量，配成0.123 mg/mL溶液，備用。

2.1.4 測定結果 分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液20μL。依次進樣，在上述色譜條件下測定，記錄色譜圖，如圖1。

圖1 蒺藜皂苷元(A)及樣品(B)的色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram s of Tribulus terrestris saponins(A)and sam p le(B)

2.2 蒺藜總皂苷的比色法測定

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取蒺藜皂苷元對照品加甲醇配制成0.123 mg/mL。

2.2.2 供試品溶液的制備 取蒺藜藥材約0.5 g，粉碎過篩 （細粉），精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇溶液50 mL，稱定質量，加熱回流處理2 h，取出放冷，再稱定質量，用甲醇補足質量，搖勻，濾過，精密吸取續濾液25 mL，回收溶劑至干，殘渣加水10mL溶解，用水飽和正丁醇振搖提取5次，每次10 mL，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2次，每次5 mL，棄去氨試液，正丁醇液蒸干。殘渣加80%甲醇溶解，轉移至50 mL量瓶中，加80%甲醇至刻度，搖勻。

2.2.3 樣品總皂苷測定 精密量取供試品2 mL，置于10 mL具塞試管中，水浴揮干甲醇，加高氯酸5.0 mL，60℃水浴保溫15 min，以不加樣品的高氯酸溶液為空白對照，在285 nm波長下進行吸光度的測定，根據回歸方程計算樣品溶液總皂苷的量。

2.3 方法學考察

2.3.1 HPLC法標準曲線 精密稱取蒺藜皂苷元對照品加甲醇配制成0.41 mg/mL，分別精密量取1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mL，以甲醇溶解并定容于10 mL量瓶中，分別量取20μL，注入HPLC色譜儀中，結果得回歸方程：y=264.947x-8.693，r=0.999 7，表明在0.82～7.38μg范圍內線性關系良好。

2.3.2 比色法標準曲線 分別吸取0.123 mg/mL對照品溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL，置于10 mL具塞試管中，揮干溶劑，加高氯酸溶液5 mL，60℃水浴保溫15 min，取出后立即冰水浴冷卻至室溫，搖勻，在285 nm測定對照品吸收度A，結果得線性方程y=0.008 6x-0.043 1，r= 0.999 2，表明在24.6～86.1μg范圍內線性關系良好。

2.3.3 精密度試驗 取對照品溶液，在 “2.1”、“2.2”項條件下，連續測定6次，結果RSD值分別為1.1%、1.2%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩定性試驗 HPLC法所制樣品于10 h內測定RSD為1.3%，比色法于1 h內測定RSD為 0.7%，供試品溶液相對穩定。

2.3.5 重復性試驗 取樣品分別按 “2.1”、“2.2”項條件下進行處理，結果RSD值分別為1.0%、1.1%，表明方法重復性良好。

2.3.6 回收率試驗 精密稱取蒺藜樣品1 g，加1.23 mg/mL對照品溶液1 mL，按“2.1.2”項下方法處理，按 “2.1.1”項下條件進行測定。精密稱取蒺藜樣品0.5 g，加入1.0 mL對照品溶液（9.81 mg/mL），按 “2.2.2”項處理，按 “2.3”項顯色后，于285 nm下測定，結果表明方法回收率試驗結果良好，具體見表1。

表1 HPLC法(比色法)回收率試驗結果Tab.1 Results of recovery tests

2.4 蒺藜炮制品制備

2.4.1 清炒 蒺藜置炒鍋內，文火加熱，不斷翻炒，至藥物表面呈黃色，取出，放涼，即得。

2.4.2 烘制 蒺藜置電熱鼓風恒溫干燥箱內，分別于120、140、200℃各烘制35 min。將上述樣品、生品置于干燥器內，放置24 h后，備用。

2.5 蒺藜皂苷、蒺藜皂苷元測定結果 按前述方法，對6個樣品進行測定，結果見表2。

表2 樣品測定結果Tab.2 Test resu lts of six sam ples

3 討論與結論

本實驗結果表明，蒺藜傳統炮制過程清炒法，其炮制結果為總皂苷下降，蒺藜皂苷元TTS的含有量有所增加。實驗結果也表明烘制法具有相同的作用結果，蒺藜經烘制后，蒺藜總皂苷含有量下降，而蒺藜皂苷元TTS的含有量有顯著增加，其中以烘制200℃，35 min最為明顯，增加了近15倍。

本課題其他實驗內容表明蒺藜皂苷元TTS具有較強的生物活性作用，因此，對于獲得更多的蒺藜皂苷元TTS成分，烘制法具有方法簡便易行，條件容易控制等優勢。可在本實驗的基礎上，經過進一步實驗后，確定烘制法作為炒制的替代炮制方法的可行性。

根據本實驗的結果，初步分析蒺藜經炮制其成分變化的過程為皂苷轉化為結構性質更為穩定的蒺藜皂苷元成分。蒺藜含有大量的皂苷類成分，其結構特點是多為甲基原薯蕷皂苷元雙糖鏈皂苷，通常在蒺藜皂苷元的C-3和C-26位均連有糖鏈，其糖鏈數量差異很大，其代表化合物為甲基原薯蕷皂苷（methylprotodioscin）如圖2中A所示。經炮制后雙糖鏈皂苷含有量降低很多，單糖鏈皂苷 （圖2中C所示）、短糖鏈皂苷 （圖2中B所示）及皂苷元 （圖2中D所示）的含有量增加，提示雙糖鏈皂苷經炮制可能存在轉化過程，過程如圖所示，本研究將通過另外實驗進一步明確雙糖鏈皂苷轉化的過程。

有報道蒺藜的嫩莖鮮品被馬、羊等動物食后會引起中毒，但曬干后可作為藥物使用，而且經炮制后應用于臨床，提示蒺藜經一定方法處理后可能存在 “減毒增效”的作用。結合本實驗結果，蒺藜經炮制后總皂苷下降，蒺藜皂苷元TTS的含有量增加，兩者是否存在一定聯系，是否蒺藜總皂苷是毒性成分，而蒺藜皂苷元是活性成分，其進一步的深入研究具有意義。

圖2 蒺藜雙糖鏈皂苷經炮制可能存在轉化過程Fig.2 Biglycan saponins of Tribulus terrestris m ay exist transformation p rocess after processing

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Effect of processing on Tribulus terrestris saponins conent

LIRui-hai， FENG Lin， MA Xin-yue， LIU Shu-ping， SUN Yan-jun， JIA Tian-zhu
（College of Pharmacy，Liaoning University of Traditional ChineseMedicine，Dalian 116600，China）

AIMTomeasure the saponins content from Tribulus terrestris before and after the processing and to speculate their processingmechanism of action.METHODSThe analyses of n-butanol part of Tribulus terrestris methanolic extractwere performed on Ultimate LP-C18column（250 mm×4.6 mm，5μm）with methanol water（80∶20）asmobile phase，the detection wavelength was setat203 nm.The perchloric acid was adopted as developer and 25R-spirostan-4-ene-3，12-dione as themarker to determine the Tribulus terrestris saponins content.RESULTS25R-spirostan-4-ene-3，12-dione had good linear relationship in the range of0.82-7.38μg for HPLC and 24.6-86.1μg for colorimetry，their average recoveries were 99.3%and 100.7%，respectively.After stir-baking or stoving，total saponins from Tribulus terrestris decreased，and 25R-spirostan-4-ene-3，12-dione content increased.CONCLUSIONThe experimental data shows that stir-baking or stoving has the same effect on the processing of Tribulus terrestris，theirmechanism of action is related to the change of saponins into structural stable aglycone.

Tribulus terrestris；stir-baking；stoving；25R-spirostan-4-ene-3，12-dione；colorimetry；processing mechanism

R283

：A

：1001-1528（2015）07-1526-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.028

2014-08-06

國家藥典委員會，國家藥品標準科研項目201203

李瑞海，博士，高級實驗師，研究生導師，從事藥物制劑方面研究。Tel：（0411）85890183，E-mail：1801517231@qq.com