不同產地苦碟子中活性成分的測定

吳晶晶， 李國輝， 王貝貝， 顧 星， 李天祥， 李慶和

（天津中醫藥大學，天津300193）

不同產地苦碟子中活性成分的測定

吳晶晶， 李國輝， 王貝貝， 顧 星， 李天祥*， 李慶和

（天津中醫藥大學，天津300193）

目的考察不同產地苦碟子中主要活性成分的含有量。方法采用UV-VIS法測定總黃酮，RP-HPLC法定量測定腺苷、木犀草素和芹菜素。結果總黃酮平均含有量為 （53.498 1±9.397 0）mg/g，其中以河北承德為最高（71.833 0 mg/g）；腺苷平均含有量為 （0.145 1±0.098）mg/g，其中以陜西咸陽為最高（0.326 9 mg/g）；木犀草素平均含有量為 （0.086 0±0.034 275）mg/g，其中以內蒙赤峰為最高 （0.155 5 mg/g）；芹菜素平均含有量為（0.006 0±0.003 511）mg/g，其中以陜西咸陽為最高 （0.012 5mg/g）。結論不同產地苦碟子藥材活性成分含有量差異較大。

苦碟子；產地；總黃酮；腺苷；木犀草素；芹菜素

苦碟子來源于菊科植物抱莖苦荬菜Ixeris sonchifolia（Bge.）Hance的地上部分，為二年生草本植物。以干燥全草入藥，其味苦、性微寒，具清熱祛火、消炎解毒、涼血消腫、祛瘀止痛、補虛止咳之功效；民間主要用于治療闌尾炎、扁桃體炎、無名腫痛等癥［1］。主要含有黃酮類、腺苷類、三萜類和倍半萜內酯類等成分，其中黃酮類和腺苷類為主要活性成分［2］。現代藥理研究表明，苦碟子具有保護心腦血管系統、抗腫瘤、抗病毒、調節血脂等作用［3-10］。目前，苦碟子的質量評價主要考察某單一成分含有量或某一省區不同產區的含有量［11-13］；且 《中國藥典》未收錄此藥，其還沒有統一的質量評價標準。為保證質量，可以從多成分、多產地較全面地對苦碟子進行成分定量考察，并進行分析評價。本研究以苦碟子主要活性成分總黃酮、腺苷、木犀草素和芹菜素為指標，對全國主要產地天津 （薊縣）、陜西 （咸陽、榆林）、山西（長治、永濟）、河南 （信陽獅河港、林州、桐柏）、內蒙 （赤峰）、遼寧 （丹東）以及河北 （易縣、承德）7個產區、12個不同產地苦碟子地上部分進行主要成分定量測定，為進一步研究、開發苦碟子提供科學依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 紫外-可見分光光度計 （上海美普達有限公司），Alltech 1500系列Q05型高效液相色譜儀 （UV 1000型全波段可編程紫外檢測器），FA 2104N電子天平 （上海舜宇恒平科技儀器有限公司），SB25-12DJ超聲波清洗機 （寧波新芝生物科技股份有限公司），FZ-6050型真空干燥箱 （上海新苗醫療器械制造有限公司）。

1.2 試藥 對照品蘆丁 （批號MUST-12040302）；腺苷 （批號110879-200202）；木犀草素 （批號MUST-11051001）；芹菜素 （批號MUST-10031801）購自國家食品藥品檢定研究院。石油醚、磷酸、無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉為分析純；甲醇、乙腈為色譜純；市售娃哈哈純凈水；蒸餾水。藥材采自12個產地，原植物經天津中醫藥大學李天祥副教授鑒定為菊科植物抱莖苦荬菜Ixeris sonchifolia（Bge.）Hance地上部分。

2 方法與結果

2.1 苦碟子總黃酮測定

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒定質量的蘆丁對照品25.71 mg，置25 mL量瓶中，用70%乙醇溶解并定容，搖勻，即得 1.028 4 mg/mL對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取苦碟子粉末 （過60目篩）約0.5 g，精密稱定，加90 m L石油醚索氏回流2 h至無色，棄去石油醚，藥渣揮去石油醚，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，稱定質量，超聲提取50 min，放冷，再稱定質量，用70%乙醇補足減失的質量，離心5 min，取上層離心液，即得供試品溶液。

2.1.3 線性關系考察和標準曲線的制備 精密吸取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL對照品溶液于10 mL量瓶中制成一系列標準溶液。分別加入70%乙醇1 mL，加5%亞硝酸鈉0.4 mL搖勻，靜置6 min，再加5%硝酸鋁0.4 mL搖勻，靜置6 min，再加5%氫氧化鈉試液4.0 mL，用70%乙醇稀釋至刻度搖勻，靜置15 min后，以70%乙醇溶液作為參比溶液，照紫外-可見分光光度法 （《中國藥典》2010年版一部附錄VA），在505 nm波長處測定吸光度。以吸光度對溶液質量濃度進行回歸分析，結果在20.57～71.99μg/mL范圍內呈良好線性關系。回歸方程y=12.533 3x-0.007 9（r= 0.999 3）。

2.1.4 測定方法 精密量取供試品溶液0.5 mL，置于10 m L量瓶中，分別加入70%乙醇1 mL，照“2.1.3”項下顯色方法操作，在505 nm波長處測定吸光度。根據標準曲線，計算出苦碟子中總黃酮的量。

2.1.5 精密度試驗 取對照品溶液適量，按“2.1.3”項下方法，連續測定6次吸光度。RSD為0.03%。

2.1.6 穩定性試驗 取同一供試品溶液，于0、20、40、 60、 80、 100、 120 min 測定， 按“2.1.3”項下方法測定其吸光度，結果RSD為1.7%，表明供試品溶液顯色后在2 h內穩定。

2.1.7 重復性試驗 取天津產苦碟子樣品6份，按 “2.1.2”項下方法制備，按 “2.1.3”項下方法測定吸光度，結果RSD為0.9%。

2.1.8 加樣回收試驗 精密稱取已知成分含有量天津產苦碟子藥材0.25 g，精密稱定，6份，分別精密加入蘆丁對照品溶液（1.028 4 mg/mL）適量，加90 m L石油醚索氏回流2 h至無色，棄去石油醚，藥渣揮去石油醚，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，稱定質量，超聲提取50 min，放冷，再稱定質量，用70%乙醇補足減失的質量，離心5 min，取上層離心液，精密吸取0.25 mL，置10 mL量瓶中，照“2.1.4”項測定法項下的方法，依法測定吸光度，計算回收率。結果顯示平均回收率為103.0%，RSD值為1.5%，見表1。

表1 總黃酮加樣回收率試驗結果Tab.1 Results of recovery tests for total flavonoids

2.2 苦碟子中腺苷測定

2.2.1 色譜條件 Welch Ultimate C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相為甲醇-水（13∶87）；體積流量1 mL/min；柱溫為室溫；檢測波長260 nm；進樣量20μL。色譜圖見圖1。

圖1 腺苷對照品(A)和樣品(B)HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram s of reference adenosine(A)and sam p le(B)

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒定質量的腺苷對照品7.28 mg，置10 m L量瓶中，用純凈水溶解并定容，搖勻，即得0.728 mg/mL對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取苦碟子粉末 （過60目篩）約0.2 g，精密稱定，置于5mL量瓶中，精密加入純凈水5 mL，稱定質量，超聲提取40 min，在85℃下水浴加熱10 min，放冷，再稱定質量，用純凈水補足減失的質量，搖勻，離心5 min，取上層離心液，用微孔濾膜 （0.45μm）濾過，取續濾液即得。

2.2.4 線性關系考察 精密量取對照品溶液，稀釋成質量濃度分別為 0.728、2.912、5.096、

7.280 、9.460、11.648、13.832 μg/mL。 按“2.2.1”項下色譜條件測定峰面積。以峰面積（y）為縱坐標，對照品質量濃度（x）為橫坐標作圖，得回歸方程：y=36 838x-1 683.5，r=0.999 7，表明腺苷在0.728～13.832μg/mL范圍內與峰面積呈良好線性關系。

2.2.5 精密度試驗 取對照品溶液，按 “2.2.1”項下色譜條件連續進樣6次，計算 RSD值為1.1%。

2.2.6 穩定性試驗 取天津產苦碟子樣品，按“2.2.3”項下方法制備，并且按 “2.2.1”項色譜條件下每隔1.3 h測定其峰面積，測定6次，其RSD值為2.4%，表明樣品在8 h之內測定穩定。

2.2.7 重復性試驗 取天津產苦碟子樣品6份，在 “2.2.3”項下方法制備，按 “2.2.1”項下色譜條件下測定峰面積，RSD值為0.8%。

2.2.8 加樣回收試驗 精密稱取已知成分含有量天津產苦碟子藥材0.1 g，精密稱定，6份，分別加入腺苷對照品溶液（0.728 mg/mL）適量，置于5 mL量瓶中，精密加入純凈水5 mL，稱定質量，超聲提取40 min，在85℃下水浴加熱10 min，放冷，再稱定質量，用純凈水補足減失的質量，搖勻，離心5 min，取上層離心液，用微孔濾膜 （0.45μm）濾過，取續濾液即得。在“2.2.1”項下色譜條件測定峰面積，計算回收率。結果顯示平均回收率為100.8%，RSD值為2.4%，見表2。

表2 腺苷加樣回收率試驗結果Tab.2 Results of recovery tests for adenosine

2.3 苦碟子中木犀草素與芹菜素測定

2.3.1 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱（2）（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相為甲醇-0.2%磷酸（0～16 min，52%A；16～25 min，52%～85%A）；體積流量1 m L/min；柱溫為室溫；檢測波長336 nm；進樣量20μL。色譜圖見圖2。

圖2 混合對照品(C)和樣品(D)HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chrom atogram s of m ixed reference substances(C)and sam p le(D)

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取木犀草素、芹菜素對照品適量，置于10mL量瓶，用甲醇溶解定容至刻度，搖勻，得木犀草素0.228 mg/mL、芹菜素0.024 5 mg/mL的對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 取苦碟子粉末 （過60目篩）1.0 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入90%乙醇25 mL，超聲提取30 min，靜置，吸取上清液。重復以上操作兩次，合并上清液，過濾，減壓濃縮至干，殘渣加甲醇使溶解并轉移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.3.4 線性關系考察 精密量取對照品溶液適量，稀釋成木犀草素的質量濃度分別為2.28、9.12、15.96、22.80、29.64、36.48、43.32μg/mL，芹菜素的質量濃度分別為0.245 0、0.857 5、1.470 0、2.082 5、2.695 0、3.307 5μg/mL。按 “2.3.1”項下色譜條件進行測定。以峰面積 （y）為縱坐標，進樣質量濃度（x）為橫坐標作圖，回歸方程：木犀草素y=42 624.570 1x-46 957.087 3，r=0.999 4；芹菜素y=56 975.455 8x-1 437.208 9，r=0.999 0。結果顯示，木犀草素、芹菜素分別在2.28～43.32 μg/mL、0.245 0～3.307 5μg/mL范圍內與峰面積呈良好線性關系。

2.3.5 精密度試驗 取混合對照品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件連續進樣6次，計算木犀草素、芹菜素峰面積RSD值分別為0.4%、0.7%。

2.3.6 穩定性試驗 取天津產苦碟子樣品，按“2.3.3”項下方法制備，并且按 “2.3.1”項下色譜條件每隔2.5 h測定其峰面積，測定10次，其木犀草素、芹菜素RSD值分別為0.6%、2.8%，表明樣品在25 h之內測定穩定。

2.3.7 重復性試驗 取天津產苦碟子樣品6份，在 “2.3.3”項下方法制備，按 “2.3.1”項下色譜條件下測定峰面積，木犀草素、芹菜素RSD值分別為1.2%、2.5%。

2.3.8 加樣回收試驗 精密稱取已知含有量天津產苦碟子藥材0.5 g，精密稱定，6份，分別加入木犀草素對照品溶液（0.228 mg/mL）和芹菜素對照品溶液（0.0245 mg/m L）適量，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入90%乙醇25 mL，超聲提取30 min，靜置，吸取上清液。重復以上操作兩次，合并上清液，過濾，減壓濃縮至干，殘渣加甲醇使溶解并轉移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，即得。在 “2.3.1”項下色譜條件測定峰面積，計算回收率。結果顯示木犀草素、芹菜素平均回收率分別為97.1%、99.2%，RSD值分別為2.1%、2.6%，見表3。

2.4 樣品測定 取不同產地苦碟子樣品，按“2.1”項、“2.2”項、“2.3”項下制備供試品溶液并測定，結果見表4。

表3 木犀草素與芹菜素加樣回收率試驗結果Tab.3 Results of recovery tests for luteolin and apigenin

表4 樣品測定結果(n=3)Tab.4 Determ ination resu lts of samples(n=3)

3 討論

3.1 脫脂溶劑的選擇 本實驗測定苦碟子中總黃酮，用索氏提取并脫脂，對比了三氯甲烷與石油醚的脫脂效果，結果表明三氯甲烷與石油醚脫脂后，總黃酮的含有量差異不明顯，且三氯甲烷脫脂時間較長，毒性較大，故本實驗采用石油醚脫脂。

3.2 提取方法的選擇 本實驗測定苦碟子中腺苷，考察了回流提取、超聲提取和先超聲后水浴保溫的方法，結果表明先超聲后水浴保溫方法，方法學驗證結果較優，測定的質量分數高，因此本實驗選擇先超聲后水浴保溫方法提取苦碟子中的腺苷。

3.3 檢測波長的選擇 本實驗測定苦碟子中木犀草素和芹菜素時，對木犀草素與芹菜素分別進行了全波長掃描，木犀草素最大吸收波長為348.5 nm和336 nm，芹菜素為335.5 nm，故選擇對木犀草素和芹菜素均有較好響應的波長336 nm作為檢測波長。

3.4 流動相的選擇 在測定木犀草素和芹菜素時，先后考察了甲醇-水、甲醇-0.2%磷酸，乙腈-0.2%磷酸流動相系統進行梯度洗脫，經比較，采用甲醇-0.2%磷酸作為流動相，基線穩定，色譜圖分離效果最好。

3.5 結果分析 根據定量測定結果可知，其中總黃酮量最高的產地為河北承德達71.833 0 mg/g，腺苷、芹菜素以陜西咸陽最高，分別為0.326 9 mg/g、0.012 5 mg/g，木犀草素內蒙赤峰最高為0.1555 mg/g。不同產地苦碟子藥材中總黃酮、腺苷、木犀草素和芹菜素含有量差異較大，這可能與產地、氣候條件、土壤環境等條件有關。

［1］江蘇新醫學院.中藥大辭典：上冊［M］.上海：上海人民出版社，1977.

［2］封錫志.抱莖苦荬菜的化學成分和生物活性研究［D］.沈陽：沈陽藥科大學，2001.

［3］陳春光，賈洪麗，呂首旭，等.苦碟子注射液對大鼠急性腦缺血-再灌注損傷的保護作用［J］.中國臨床藥理學雜志，2012，28（3）：196-197，199.

［4］劉秋庭，涂鄂文，譚達全，等.苦碟子注射液對急性腦梗死白細胞介素6及腫瘤壞死因子α的影響［J］.湖南中醫雜志，2014，30（5）：38-39.

［5］王巧玲，劉青程，靜 英.苦碟子注射液在腦梗死中的應用價值研究［J］.浙江中醫藥大學學報，2014，38（5）：590-592.

［6］何志超，嚴惠明，李國成，等.苦碟子注射液治療冠心病心絞痛的Meta分析［J］.中成藥，2014，36（2）：253-258.

［7］周曉棉，鄭洪浩，曹春陽，等.苦碟子注射液的抗腫瘤作用［J］.沈陽藥科大學學報，2007，24（2）：103-108.

［8］王建國，姜 哲，謝遵江.苦碟子對惡性黑色素瘤細胞抑制及凋亡蛋白Bcl-2/Bax表達的影響［J］.解剖科學進展，2013，19（2）：148-152.

［9］柳曉琳，何雅慧，金艷書，等.苦碟子抗呼吸道病毒的實驗研究［J］.中國現代中藥，2006，8（1）：11-15.

［10］趙艷威，謝文利，于曉風，等.苦碟子皂苷對高脂血癥大鼠血脂代謝的影響及其抗氧化作用［J］.武警醫學院學報，2005，14（3）：165-168.

［11］張 晶，佟全勝，董金平，等.高效液相色譜法測定抱莖苦荬菜中木樨草素及芹菜素的含量［J］.時珍國醫國藥，2009，20（4）：866-868.

［12］王鳳秋，劉志梅，張建軍，等.HPLC法測定遼寧地區苦碟子中腺苷的含量［J］.沈陽醫學院學報，2010，12（2）：110-111.

［13］胡德奇，劉志梅，王鳳秋，等.遼寧省不同地區苦碟子中總黃酮含量測定及比較研究［J］.遼寧中醫藥大學學報，2010，12（10）：189-190.

Determ ination of active constituents in Ixeris sonchifolia（Bge.）Hance from different grow ing areas

WU Jing-jing， LIGuo-hui， WANG Bei-bei， GU Xing， LITian-xiang*， LIQing-he
（Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

AIMTo study the contents of active constituents in Ixerissonchifolia from differentgrowing areas.METHODSUV-VISmethod was used to determine the content of total flavonoids，and using RP-HPLCmethod to determine the contents of adenosine，luteolin and apigenin.RESULTSThe average contentof total flavonoids was 53.498 1±9.397 0 mg/g，the highestwas71.833 0 mg/g in Chengde District，Hebei Province；the average adenosine contentwas0.145 1±0.098 mg/g，the highestwas0.326 9 mg/g in Xianyang District，Shanxi Province；the average luteolin contentwas 0.086 0±0.034 275 mg/g，the highestwas 0.155 5mg/g in Chifeng District，Inner Monglia Area；the average apigenin contentwas 0.006 0±0.003 511 mg/g，the highestwas0.012 5 mg/g in Xianyang District，Shanxi Province.CONCLUSIONThere are significant differences in contents of active constituents in Ixeris sonchifolia among different growing areas.

Ixeris sonchifoia（Bge.）Hance；growing area；total flavonoids；adenosine；luteolin；apigenin

R284.1

：A

：1001-1528（2015）07-1538-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.031

2014-08-22

生多調查 （環）：第四次全國中藥資源普查天津試點；天津市科技支撐計劃項目 （10ZCZDSY12400）

吳晶晶 （1989—），女，碩士生，主要從事中藥質量控制與資源開發研究。Tel：15900259817，E-mail：1056995200@ qq.com

*通信作者：李天祥（1966—），男，博士，副教授，Tel：（022）59596262，E-mail：litianxiang612@sina.com