響應面法優選天花粉總皂苷的提取工藝

黃慶勇， 葉 淼， 李 煌， 張玉琴， 褚克丹， 徐 偉， 喬麗菲， 張國良

（福建中醫藥大學藥學院，福建福州350122）

響應面法優選天花粉總皂苷的提取工藝

黃慶勇， 葉 淼， 李 煌， 張玉琴， 褚克丹， 徐 偉*， 喬麗菲， 張國良

（福建中醫藥大學藥學院，福建福州350122）

目的利用響應面法對天花粉總皂苷的回流提取工藝進行優化。方法在單因素試驗基礎上，選取料液比、提取時間、乙醇體積分數和提取溫度為自變量，以天花粉總皂苷提取率為響應值，根據Box-Behnken中心組合設計原理，采用四因素三水平的響應面分析法。結果天花粉總皂苷提取的最佳條件為料液比1∶15，提取時間120 min，乙醇體積分數48%，提取溫度88℃，提取2次，總皂苷提取率可達0.93%。結論該優選工藝穩定可行，實驗真實值與建立的模型預測值基本一致。

天花粉；總皂苷；提取工藝；響應面法

栝樓屬植物有80多種，其中我國有40多種，是栝樓屬植物的主要分布中心［1］，其中栝樓常用于臨床中藥。天花粉來源于葫蘆科植物栝樓Trichosanthes kirilowii Maxim.和雙邊栝樓Trichosanthes rosthornii Harms的干燥根，始載于《神農本草經》，具有清熱滌痰、寬胸散結等功效，代表方有：栝樓桂枝湯、栝樓牡蠣散和栝樓瞿麥丸［2］。天花粉的主要成分包括蛋白質［3］、多糖、有機酸和三萜皂苷［4］等，具有抗病毒、抗炎和抗腫瘤等藥理作用［5］。研究表明天花粉總皂苷能夠清除DPPH自由基，具有體外抗氧化活性［6］，且對缺血性腦血管疾病具有較好的治療作用［7］。

與傳統的正交設計相比［8］，響應面法能夠在給出的整個區域找到因素和響應值之間的一個明確的函數表達式，從而找到整個區域中因素的最佳組合和響應的最優值［9］。該方法已廣泛運用于食品［10］，化工［11］，機械［12］，藥學［13］等領域研究中。本實驗通過單因素考察提取的時間、溫度、溶劑和物料比，結合響應面法優選天花粉總皂苷的提取工藝，并驗證該方法的可行性，旨在為天花粉總皂苷的工業化生產及保健產品的研發提供理論依據。

1 材料與儀器

1.1 材料 天花粉購自河北省安國市天康藥材有限公司，經福建中醫藥大學楊成梓教授鑒定為葫蘆科植物栝樓Trichosanthes kirilowii Maxim.的干燥根。齊墩果酸對照品（購買自成都曼思特生物科技有限公司，批號MUST-11090502，HPLC級），無水乙醇、冰醋酸、高氯酸、香草醛均為分析純試劑。

1.2 儀器 CPA225D型電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；UV-1800型紫外可見分光光度計 （島津）；HH-2型數顯恒溫水浴鍋 （國華電器有限公司）；RE-2000A型旋轉蒸發器 （上海亞榮生化儀器廠）。

2 方法與結果

2.1 總皂苷測定方法［14］

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取齊墩果酸對照品1.90 mg，置于10mL量瓶中，加入無水乙醇超聲溶解，稀釋至刻度搖勻，即得0.19 mg/mL的齊墩果酸對照品溶液。

2.1.2 標準曲線繪制 精密吸取齊墩果酸對照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置于10 mL的量瓶中，80℃恒溫水浴蒸干，加入新鮮配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL和高氯酸0.8 m L，60℃反應10 min，冰浴冷卻后，加冰醋酸稀釋至刻度，搖勻，在550 nm波長下測定吸光度，以加入齊墩果酸對照品溶液0 mL的溶液為空白對照。以吸光度為縱坐標，齊墩果酸質量濃度為橫坐標，得回歸方程Y=4.471 0X-0.025 9（r=0.999 7），表明齊墩果酸質量濃度在0.038～0.190 mg/mL范圍內與吸光度呈良好的線性關系。

2.1.3 供試品溶液的制備 將天花粉粉碎，過80目篩，精確稱取天花粉粉末5.0 g，置于250 m L圓底燒瓶中，按單因素條件及Box-Behnken試驗設計進行回流提取，提取2次，趁熱濾過，合并濾液，減壓濃縮至干，用適宜體積分數乙醇超聲溶解，定容于10 mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.4 精密度考察 取同一供試品溶液，按 “2.1.2”項下方法操作，連續測定6次，得RSD為1.54%，表明儀器精密度良好。

2.1.5 重復性考察 精密稱取6份天花粉粉末，按“2.1.3”項下方法進行提取，按 “2.1.2”項下方法測定吸光度，RSD為1.92%，表明該方法重復性良好。

2.1.6 穩定性考察 取同一供試品溶液，按 “2.1.2”項下步驟，分別在0、5、10、30、60、120 min測定，得出總皂苷吸光度的RSD為0.72%，表明樣品溶液在120 min內基本穩定。

2.1.7 加樣回收率試驗 取已知含有量的天花粉粉末 （總皂苷為0.73%）6份，分別加入齊墩果酸對照品約0.02 mg，按上述方法進行處理，測定各供試品溶液的吸光度值，按照公式 ［回收率 （%）=（加標樣品實測值-樣品測定值）/加入對照品量 ×100%］計算平均回收率為98.8%，RSD為2.65% （n=6），結果表明方法準確度較高，符合測定要求。

2.1.8 樣品測定 精密量取0.2 mL供試品溶液，置10mL的試管中，80℃恒溫水浴蒸干，按 “2.1.2”項下步驟進行測定。天花粉總皂苷提取率 （%）=天花粉總皂苷提取質量/天花粉量×100%

2.2 單因素試驗 以天花粉總皂苷提取率 （Y）為考察指標，按 “2.1.3”項下方法進行處理，后按 “2.1.2”項下測定吸光度。分別考察料液比 （A）、提取時間 （B）、乙醇體積分數 （C）和提取溫度 （D）對總皂苷提取率的影響 （見圖1）。

圖1 單因素試驗結果

單因素試驗結果表明：由圖1A可知，當料液比為1∶15時，提取率最高，故選擇1∶15為宜。由圖1B可知，當提取時間為120 min時，提取率有最大值，隨提取時間的增加，提取率沒有明顯增加，從經濟效益方面考慮，選擇120min較適合。由圖1C可知，提取率在用50%乙醇溶液提取時最高，之后隨乙醇體積分數的增大而減小，故選用50%乙醇進行提取。由圖1D可知，提取率隨提取溫度的增加而增加，當溫度為80℃時，提取率最高。

2.3 響應面實驗考察

2.3.1 試驗設計與結果 根據Box-Behnken中心組合試驗設計原理［15］，在單因素試驗基礎上，以料液比 （A）、提取時間 （B）、乙醇體積分數 （C）和提取溫度 （D）4個因素為自變量。每個自變量的低、中、高水平分別以-1，0，1進行編碼，以天花粉總皂苷提取率 （Y）為響應值，因素水平見表1，試驗安排及結果見表2。

表1 天花粉總皂苷的提取工藝Box-Behnken中心組合試驗因素水平

表2 天花粉總皂苷的提取工藝Box-Behnken中心組合試驗安排

2.3.2 響應面分析 利用ANOVA分析效應面的回歸參數。采用DesignExpert8.0.6軟件對表2中數據進行多元回歸擬合，得到的二次多元回歸方程：Y=0.91+0.032A+0.033B-4.167×10-3C+0.048D+7.50×10-3AB+0.080AC-0.013AD-0.020BC-0.045BD-0.043CD-0.063A2-0.064B2-0.082C2-0.035D2。回歸方程中的各項系數見表3。

表3 回歸方程的顯著性檢驗及方差分析

由表3可知：F回歸=22.63，P＜0.000 1，表明該模型極顯著，方程與實際情況擬合良好；失擬項P=0.053 6＞0.05，失擬檢測不顯著，表明未知因素對試驗結果干擾小；模型相關系數 R2=0.957 7，表明可信度良好；R2

Ad j= 0.915 4，說明91.54%的實驗數據可用該模型進行解釋。綜上，該模型可以對天花粉中總皂苷提取工藝進行分析和預測。

回歸方程各項方差分析表明，因素A，B，D，AC，A2，B2，C2對提取率影響極顯著，因素BD，CD，D2具有一定的顯著性，其余均不顯著，表明各影響因素與總皂苷得率之間并非簡單的線性關系。從F值可以看出，單因素的影響順序為D＞B＞A＞C。

響應面分析立體圖見圖2，各圖為當料液比 （A）、提取時間 （B）、乙醇體積分數 （C）和提取溫度 （D）中任意兩個變量取零水平時，其余兩個變量對提取率的影響，可更加直觀體現兩個因素對提取率的影響。

圖2A顯示，當乙醇體積分數為50%、提取溫度為80℃時，料液比和提取時間對總皂苷提取率的交互作用。根據等高線形狀以及響應曲線陡峭程度，可判斷兩者的交互作用不顯著。提取率隨料液比或提取時間的增加或減少，變化不明顯。

圖2B顯示，在提取時間為120 min、提取溫度為80℃的條件下，料液比一定時，提取率隨乙醇體積分數的增大，呈先增大后減小的趨勢，當乙醇體積分數為60%時，提取率最小。當乙醇體積分數為40%時，提取率隨料液比的增長，總體呈減小的趨勢。等高線呈橢圓形，響應曲線坡度較陡，表示兩者交互作用極顯著。

圖2C顯示，料液比和提取溫度對總皂苷提取率的交互作用。當乙醇體積分數、提取時間一定時，提取率隨提取溫度的升高而顯著增加，隨料液比增大也有一定增加趨勢，當料液比約為1∶16時，有極大值。

圖2 交互因素對總皂苷提取率影響的等高線及響應曲面圖

圖2D顯示，當料液比為1∶15、提取溫度為80℃時，提取率隨提取時間及乙醇體積分數的增加，由低到高又降低，即提取率在適合的提取時間及乙醇體積分數小具有極大值。

圖2E、2F顯示，提取時間和提取溫度，乙醇體積分數和提取溫度交互作用顯著，表現為響應曲線陡峭，等高線呈橢圓形且較密集，說明提取時間和提取溫度，乙醇體積分數和提取溫度對總皂苷提取率有一定的影響。

綜上，料液比 （A）和乙醇體積分數 （C）對天花粉總皂苷得率的影響最顯著。在給定范圍內，提取溫度越高（D），總皂苷的提取率越大；當料液比 （A）為1∶16時，提取率可能有極大值。

2.3.3 最佳條件的預測和驗證試驗 用DesignExpert軟件對表2結果進一步處理，可得出最優條件為：料液比 （A）1∶15.15，提取時間 （B）120.16 m in，乙醇體積分數 （C）47.77%，提取溫度 （D）88.13℃，天花粉總皂苷提取率的預測值為0.928%。考慮實際操作問題，以此條件的參數對工藝方法進行修正：料液比 （A）1∶15，提取時間 （B）120 min，乙醇體積分數 （C）48%，提取溫度 （D）88℃。根據上述條件，平行測定3次，天花粉總皂苷提取率分別為0.937、0.931、0.928%，平均值為0.932%，RSD為0.49%，與預測值的偏差為0.43%。

3 討論

前期工作中，曾比較不同溶劑 （甲醇、乙醇）和不同提取次數對天花粉總皂苷提取率的影響，結果發現不同溶劑提取率差別不顯著，而隨提取次數的增大，提取率增加不明顯，從經濟效益方面考慮，最后確定利用乙醇對天花粉進行提取，提取次數為2次。

本實驗進行了29個實驗點 （5個中心點）的響應曲面分析試驗，相比目前國內多采用的正交設計或均勻設計優化工藝方法，可以評價指標和因素間的非線性關系，結果更精準，具有更強的指導性。實驗比較了料液比、提取時間、乙醇體積分數和提取溫度四個因素對提取率的影響，考察較全面。建立了二次多項回歸模型，模型擬合良好，可用于天花粉總皂苷提取工藝的研究。最佳工藝條件確定為：料液比1∶15，提取時間120 m in，乙醇體積分數48%，提取溫度88℃，天花粉總皂苷實測得率為0.932%。

天花粉能夠降血糖［16］，對缺血性腦卒中［17］有一定的保護作用，但具體的有效部位及有效成分尚未闡明。本實驗主要關注天花粉總皂苷的提取工藝，在今后工作中，將對其純化工藝及藥理活性進行深入探討。

致謝:

本課題在康復技術協同創新中心和國家中醫藥管理局中醫康復研究中心資助下完成。

本實驗在福建省科技廳福建省中藥學重點實驗室中完成。

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2014-03-12

福建省科技廳重點項目 （2012Y0041）；福建省教育廳項目 （JA12176）；福建中醫藥大學校管科研課題 （X2013016）

黃慶勇 （1989—），男，碩士生，從事中藥藥劑及質量標準控制研究。Tel：15806034728，E-mail：hqy8910@163.com

*通信作者：徐 偉（1975—），男，副教授，碩士生導師，主要從事天然藥物化學成分與活性研究。E-mail：xwfjtcm@sina.com

日期：2014-06-30

網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/31.1368.R.20140630.1350.001.html