叔丁基過氧化氫誘導小梁網細胞氧化應激模型的建立

楊玉霞 劉 杏 黃晶晶 鐘毅敏 肖 輝

氧化應激的概念源自人類對衰老的研究。1956年，Harman［1］將衰老和氧化聯系起來，提出了衰老的自由基學說。他認為自由基(free radical)包括O2-及其衍生物通過攻擊生物高分子對組織細胞造成的損傷是導致衰老的原因，也是導致多種疾病的重要因素。1990 年，Sohal 等［2］提出的氧化應激概念，補充和發展了自由基學說，認為機體細胞存在著氧化系統和抗氧化系統的平衡，年輕的細胞維持著氧化和抗氧化的平衡，但是如果氧化應激過多，細胞則需要更多的能量來清除自由基，而細胞可利用的能量是有限的，當自由基超出了細胞抗氧化的能力時，氧化應激導致的損傷便發生了。Bunin［3］研究發現青光眼患者眼內抗氧化屏障功能減退，包括房水中抗壞血酸濃度降低，POAG 小梁組織內GST 含量降低，其幅度與病程相關。青光眼患者房水內總抗氧化還原電位(TRAP)較白內障患者減少64%，且與SOD 和GST過氧化物酶活性增加相關［3，4］。Izzotti 等［5］認為，氧化損傷正是原發性開角型青光眼發病機制中“青光眼鏈”的開始。為了進一步研究小梁細胞氧化應激損傷的機制，筆者建立小梁細胞(immortalized human trabecular meshwork cells，iHTM)的叔丁基過氧化氫(tert-butyl hydroperoxide，tBHP)氧化刺激模型，并觀察氧化應激后小梁細胞活性、細胞活性氧、蛋白酶體復合物活性以及細胞凋亡的變化情況。

材料與方法

1.試劑:正常人小梁細胞系iHTM 為加拿大魁北克Laboratory of Ocular Genetics and Genomics 的Vincent Raymond 教授所贈。DMEM/F12 培養基，胎牛血清(fetal calf serum，FCS)均購自Gibco 公司。噻唑藍(3，24，5 dimethyliazol 22，5 diphenyl tetrazolium bromide，MTT)、Hochest33258、tBHP 購自美國Sigma-Aldrich 公司，多聚甲醛購自北京化工廠，活性氧檢測試劑盒購自中國碧云天生物技術研究所，蛋白酶體復合物檢測試劑盒購自美國Promega 公司，Annexin-Ⅴ/PI 凋亡檢測試劑盒購自美國BioVision 公司。酶聯免疫檢測儀為美國BioTek 公司，激光共聚焦熒光顯微鏡為德國Zeiss 公司(LSM 510 Meta 型)。美國BD 公司FACSAria 型流式細胞儀和BD FACSiva software 數據分析軟件。

2.實驗分組:陰性對照組(control)為正常培養的細胞，不用tBHP 進行處理。tBHP 處理1h 組(tBHP1h):為含200μmol/L tBHP 的DMEM 工作液培養1h。tBHP 處理2h 組(tBHP2h):為含200μmol/L tBHP 的DMEM 工作液培養2h。

3.MTT 法檢測tBHP 刺激后小梁細胞的活性:將細胞按上述方法分別處理后，調節細胞濃度為1 ×105/ml，取80μl 加入96 孔板中，加入培養液至180μl，再加入MTT 液20μl，，每一處理條件設6 個重復孔，同時設置調零孔(只加培養基、MTT、二甲基亞砜)。繼續培養4h 后棄去上清液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)200μl，充分混勻，在酶聯免疫檢測儀上測定每孔的吸光度(A 值)，波長為490nm，以反映活細胞的數目。

4.流式細胞術檢測tBHP 刺激后小梁細胞活性氧水平:將iHTM 細胞接種于6 孔板中，待細胞長至80%融合，去除細胞培養液，每孔加入1ml 終濃度為10μmol/L 的DCFH-DA。將細胞置于37℃細胞培養箱內孵育20min。用無血清細胞培養液洗滌細胞3 次，充分去除未進入細胞內的DCFH -DA。按前面所述，加入tBHP 工作液，待培養1h 和2h 后，收集細胞進行流式細胞儀檢測。

5.Suc-LLVY-GloTM substrate 檢測tBHP 刺激后小梁細胞糜蛋白酶樣蛋白酶體復合物的活性:將iHTM 細胞以5 ×104/ml 的密度接種在96 孔的白板中，每孔200μl。待細胞生長至80%融合，使用tBHP 對細胞進行刺激，如前所述。使用美國Promega 公司的Chymotrypsin-like Cell-Based Assays 檢測糜蛋白酶樣蛋白酶體復合物的活性。操作步驟依試劑盒說明進行，使用酶標儀檢測熒光強度(RLU)，RLU 的高低反映了糜蛋白酶樣蛋白酶體活性的強弱。

6.Hoechst33258 檢測tBHP 刺激后小梁細胞的凋亡:將細胞按上述方法分別處理后，收集細胞，PBS 洗滌，吹散，用微量加樣槍滴片，風干，甲醇固定。水洗3min，用Hoechst 33258 染色5min，晾干，甘油封片。共聚焦顯微鏡下觀察。

7.流式細胞術檢測tBHP 刺激后小梁細胞的凋亡:將細胞按上述方法分別處理后，收集細胞(細胞數量≥1 ×109個/升)。取1ml 細胞懸液按Annexin-Ⅴ/PI 雙染試劑盒操作說明進行檢測。1h 內使用流式細胞檢測儀進行定量檢測，并進行數據分析。

8.統計學方法:本研究所涉及的組間之間的比較均采用SPSS 16.0 統計分析軟件進行分析，數據結果以均數±標準差(±s)表示，采用方差分析(one - way ANOVA)進行組間比較。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1.tBHP 刺激后小梁細胞形態學的改變:正常培養的小梁細胞呈梭形，折光性好，貼壁良好;tBHP 處理1h 后，部分細胞變圓、脫落、皺縮;tBHP 處理2h后，大部分細胞變圓、皺縮、懸浮于培養液中(圖1)。

圖1 經tBHP 處理后小梁細胞形態學改變(×100)

2.tBHP 刺激后小梁細胞活性的改變:設對照組細胞活性為100%，則tBHP1h 組細胞活性為69.3% ±1.5%;tBHP2h 組細胞活性為57.9% ±2.2%(表1)。經one-way ANOVA 分析，3 組間細胞活性差異有統計學意義(F=602.327，P =0.000)。進一步對各組間的細胞活性進行兩兩比較，結果為對照組與tBHP1h 組和tBHP2h 組比較、tBHP1h 組與tBHP2h 組比較，各組間差異均有統計學意義(P 均=0.000)。

表1 tBHP 刺激后小梁細胞的改變(±s)

表1 tBHP 刺激后小梁細胞的改變(±s)

組別 細胞活性(%) 活性氧水平 凋亡率(%)蛋白酶體活性(%)100 1 3.0% ±1.8 100 tBHP1h 69.3 ±1.5 53.5 ±1.8 28.23 ±3.2 70.6 ±0.9 tBHP2h 57.9 ±2.2 121.8 ±4.2 39.2 ±5.9 74.9 ±0.5 F對照組602.3 528.4 67.8 783.5 P 0.000 0.000 0.000 0.000

3.tBHP 刺激后小梁細胞活性氧的改變:將對照組ROS 水平設為1，則tBHP1h 組ROS 水平為對照組的53.5 ±1. 8 倍;tBHP2h 組ROS 水平為對照組的121.8 ±4.2 倍(表1)。將對照組ROS 水平設為1，則tBHP1h 組ROS 水平為對照組的53.47 ±1.75 倍;tBHP2h 組ROS 水平為對照組的121. 81 ±4. 2 倍;經one-way ANOVA 分析，3 組間細胞ROS 水平差異有統計學意義(F =528.366，P =0.000)。進一步對各組間的ROS 水平進行兩兩比較，結果為對照組與tBHP1h 組和tBHP2h 組比較、tBHP1h 組與tBHP2h 組比較，P 均=0.000，各組間差異均有統計學意義。

4.tBHP 刺激后小梁細胞糜蛋白酶樣蛋白酶體復合物活性的改變:將對照組小梁細胞糜蛋白酶樣蛋白酶體復合物活性的熒光強度設為100%，則tBHP1h組小梁細胞糜蛋白酶樣蛋白酶體復合物活性較對照組下降70.6% ±0.9%;tBHP2h 組小梁細胞糜蛋白酶樣蛋白酶體復合物活性較對照組下降74. 9% ±0.5%(表1)。將對照組小梁細胞糜蛋白酶樣蛋白酶體復合物活性的熒光強度設為100%，則tBHP1h 組小梁細胞糜蛋白酶樣蛋白酶體復合物活性較對照組下降70.59% ±0.88%;tBHP2h 組小梁細胞糜蛋白酶樣蛋白酶體復合物活性較對照組下降74. 93% ±0.54%，對3 組間的小梁細胞糜蛋白酶樣蛋白酶體復合物活性進行one -way ANOVA 分析，差異有統計學意義(F=783.469，P =0.000)。進一步對各組的小梁細胞糜蛋白酶樣蛋白酶體復合物活性進行兩兩比較，結果為對照組與tBHP1h 組和tBHP2h 組比較，P均=0.000;tBHP1h 組與tBHP2h 比較，差異均有統計學意義(P=0.043)。

5.Hoechst33258 染色觀察tBHP 刺激后小梁細胞凋亡:激光共聚焦熒光顯微鏡觀察正常培養的小梁細胞，細胞核Hoechst33258 染色呈較均勻的藍色，凋亡細胞少見。經過tBHP 處理1h，部分小梁細胞發生凋亡，細胞核變小，Hoechst33258 染色呈亮白色;經tBHP 處理2h，凋亡細胞數量明顯增加(圖2)。

圖2 激光共聚焦熒光顯微鏡檢測tBHP 刺激前后小梁細胞的凋亡

6. 流式細胞術定量檢測tBHP 刺激后小梁細胞的凋亡比例:經流式細胞術定量檢測，在正常對照組iHTM 細胞中，凋亡細胞比例為3.0% ±1.8%。tBHP 1h 組凋亡細胞比例為28.23% ±3.20%，凋亡以晚期凋亡為主;tBHP 處理2h 組凋亡細胞比例為39.2% ±5.9%，且凋亡細胞以晚期凋亡和細胞壞死為主;凋亡細胞比例比對照組和tBHP1h 組明顯增加(圖3、表1)。將3 組間細胞凋亡比例進行one - way ANOVA分析，差異有統計學意義(F =67.784，P =0.000)。進一步將各組間的細胞凋亡比例進行兩兩分析，結果分別是對照組與tBHP1h 組和tBHP2h 比較，P 均=0.000;tBHP1h 組與tBHP2h 組比較，差異均有統計學意義(P=0.015)。

圖3 tBHP 刺激后小梁細胞凋亡的變化

討 論

1.氧化損傷對小梁細胞形態改變的影響:已有研究發現氧化應激是POAG 疾病發生、發展的一個重要因素。Sacca 等［6］報道氧化應激可能通過損傷小梁網，而導致眼壓升高和青光眼視神經損害的進展。在Izzotti 等［7］的一項病例對照研究中，他們檢測了包括了79 名POAG 患者和156 名正常對照者的線粒體DNA 損傷情況，發現氧化損傷在青光眼患者線粒體損傷以及啟動細胞凋亡和細胞丟失方面起了重要作用。Liu 等［8］報道在小鼠的急性高眼壓模型中，眼壓升高后數小時內視網膜神經節細胞即發生氧化損傷，說明氧化損傷在青光眼視神經病變早期即產生了影響。周琦等［9］報道氧化損傷可以使豬小梁細胞黏附因子ICAM-1 下降以及Luna 等［10］發現氧化應激可以使小梁細胞細胞外基質增加，基質蛋白酶含量下降。筆者發現培養的人小梁細胞經tBHP 刺激后，細胞變圓、收縮，由貼壁狀態變為懸浮狀態，并且隨著刺激時間的延長，細胞活性變的越來越差。

2.氧化損傷對小梁細胞活性的影響:體外誘導小梁網細胞氧化應激可使其發生類似POAG 的改變，如細胞外基質堆積、細胞溶解死亡、細胞骨架結構紊亂、脂褐素增加等，如果用抗氧化劑和降眼壓藥物預處理則可減輕這種改變［5］。持續的ROS 可破壞線粒體膜電位，最終導致小梁網損傷，房水流出受阻。對POAG 患者的研究發現，ROS 引起的小梁細胞DNA 的損傷與眼壓的升高和視野的喪失顯著相關。在小梁網氧化應激過程中，持續的活性氧刺激使負調控細胞外基質(extracellular cell matrix，ECM)相關基因表達降低，從而促進了小梁網處ECM 沉積，房水流出受阻。筆者用tBHP 作為氧化應激的刺激源，對培養的小梁細胞進行刺激，作用1h 后細胞活性下降30.70% ±1.50%，刺激2h 后，細胞活性進一步下降(42.12% ±2.20%)，說明氧化應激損傷具有時間依賴性，隨著刺激時間的延長，tBHP 對細胞造成的損傷加重。活性氧(ROS)是指化學性質活躍的含氧原子或原子團，超氧自由基(O-2)、過氧化氫(H2O2)、羥自由基(·OH)等。活性氧是細胞信號轉導必需的物質，但是過量的活性氧也會損傷線粒體、蛋白質以及核酸，對細胞造成損傷。筆者發現tBHP 刺激小梁細胞后可使細胞的活性氧增加，刺激1h 后增加53.47 ±1.75 倍，刺激2h 后增加121.81 ±4.20 倍，同樣隨著刺激時間的延長，細胞活性氧水平增加。如前所述，小梁細胞經tBHP 處理后可發生細胞變圓、收縮、由貼壁狀態變為懸浮狀態，細胞活性也顯著下降，這些可能都與ROS 的增加有關。

3.氧化損傷對小梁細胞蛋白酶體復合物活性的影響:蛋白酶體是相對分子質量為700kDa 的復合體，包含糜蛋白酶樣、胰蛋白酶樣、天冬氨酸特異性蛋白水解酶樣3 種蛋白酶活性。蛋白酶體是細胞內蛋白質降解的重要途徑，也是清除細胞內變性受損蛋白質的主要工具，它的活性反映了細胞對抗損傷的能力。泛素蛋白酶體系統功能的降低可影響眼科的多種疾病如視網膜色素病變，黃斑變性，青光眼，糖尿病視網膜病變等［11］。Guo 等［12］發現在晶狀體上皮細胞的增殖和分化過程均需要蛋白酶體的參與。張鐵英等［13］研究發現與透明晶狀體相比，白內障晶狀體上皮內蛋白酶體的糜蛋白酶樣、胰蛋白酶樣酶活性明顯降低，并認為蛋白酶體活性降低可能在老年性白內障的形成中起重要的調節作用。Zhang 等［14］報道40 ～50mmol/L 的H2O2可引起體外培養的人視網膜色素上皮細胞中蛋白酶體活性的明顯下降。Caballero等［15］報道將人小梁細胞培養于40%O2環境中，可以引起小梁細胞蛋白酶體活性的降低。筆者使用能被糜蛋白酶樣水解酶的底物Suc -Leu -Leu -Val-Tyr-AMC (LLVY)來檢測糜蛋白酶樣蛋白酶的活性，結果表明培養的人小梁細胞經tBHP 刺激后1h 后，細胞糜蛋白酶樣蛋白酶體的活性下降70. 59% ±0.88%，刺激2h 后進一步下降(74.93% ±0.54%)。在氧化應激后，蛋白酶體復合物活性下降，一方面可能是因為蛋白酶體復合物結合了大量受氧化損傷的蛋白質，造成的蛋白酶體的轉運飽和;另一方面可能是由于tBHP 直接造成了蛋白酶體復合物的氧化損害，導致了蛋白酶體復合物功能的下降。蛋白酶體復合物功能下降，細胞內受損蛋白無法及時被降解，可以加劇氧化應激對小梁網的損傷。

4.氧化損傷對小梁細胞凋亡的影響:凋亡不同于壞死，壞死是由損傷因子引起的被動死亡，因為壞死的細胞常常要釋放出內含物，所以一般會引起炎癥。而凋亡是細胞的程序化死亡過程，是能量依賴的主動的死亡過程，由凋亡通路引起，不產生炎性反應。在青光眼患者，不論視網膜還是眼前段小梁網組織都存在較高的氧化應激水平［16］。POAG 患者的小梁網組織存在著諸多形態學和生物學的異常，如細胞丟失較多，細胞骨架的改變，細胞老化現象以及亞臨床炎癥的表現。目前認為持續的氧化應激導致了這些改變［17］。筆者通過tBHP 氧化刺激體外培養的小梁細胞，發現tBHP 刺激1h 后，凋亡細胞比例為28.23% ±3.23%，刺激2h 后，凋亡細胞比例為39. 20% ±5.91%，隨著刺激時間的延長，凋亡細胞增加明顯;說明小梁細胞的氧化應激加劇了細胞的凋亡，從而造成小梁網功能損傷。

筆者的研究表明，小梁細胞經tBHP 刺激后，細胞ROS 水平增加，細胞凋亡比例增加，細胞蛋白酶體復合物的活性降低，小梁細胞活性降低，上述改變與刺激時間相關，隨著刺激時間延長，上述改變更加顯著。同時筆者發現tBHP 直接造成的細胞壞死并不多，說明tBHP 可用于小梁細胞氧化應激損傷的模型建立，并且是一種易于誘導小梁細胞凋亡的氧化劑。

1 Harman D. Aging:a theory based on free radical and radiation chemistry［J］. J Gerontol，1956，11(3):298 -300

2 Sohal RS，Allen RG. Oxidative stress as a causal factor in differentiation and aging:a unifying hypothesis［J］. Exp Gerontol，1990，25(6):499 -522

3 Bunin AI. Pathogenetic factors of destructive process in trabecular tissues in primary open-angle glaucoma［J］. Vestn Oftalmol，2000，116(5):24 -27

4 Ferreira SM，Lerner SF，Brunzini R，et al. Oxidative stress markers in aqueous humor of glaucoma patients［J］. Am J Ophthalmol，2004;137(1):62 -69

5 Izzotti A，Bagnis A，Saccà SC.The role of oxidative stress in glaucoma［J］. Mutat Res，2006，612(2):105 -114

6 Sacca SC，Pascotto A，Camicione P，et al. Oxidative DNA damage in the human trabecular meshwork -clinical correlation in patients with primary open-angle glaucoma［J］.Arch Ophthalmol 2005，123:458-463

7 Izzotti A，Sacca SC，Longobardi M，et al. Mitochondrial damage in the trabecular meshwork of patients with glaucoma［J］. Arch Ophthalmol，2010，128(6):724 -730

8 Liu Q，Ju WK，Crowston JG，et al. Oxidative stress is an early event in hydrostatic pressure induced retinal ganglion cell damage［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2007，48 (10):4580 -4589

9 周崎，劉玉琴，趙家良，等. 氧化應激對豬眼小梁細胞內皮細胞白細胞黏附分子-1 表達的影響［J］. 中國醫學科學院學報，2007，29(3):394 -397

10 Luna C，Li G，Qiu J，et al. Role of miR -29b on the regulation of the extracellular matrix in human trabecular meshwork cells under chronic oxidative stress［J］. Mol Vis，2009，28(15):2488 -2497

11 Campello L，Esteve-Rudd J，Cuenca N，et al. The ubiquitin-proteasome system in retinal health and disease［J］. Mol Neurobiol，2013，47(2):790 -810

12 Guo W，Shang F，Liu Q，et al. Ubiquitin-proteasome pathway function is required for lens cell proliferation and differentiation［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2006，47(6):2569 -2575

13 張鐵英，劉奕志，吳明星，等. 老年性白內障與透明晶狀體上皮內蛋白酶體活性的比較［J］.眼科學報，2006，22:89 -92

14 Zhang X，Zhou J，Fernandes AF，et al. The proteasome:a target of oxidative damage in cultured human retina pigment epithelial cells［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2008，49(8):3622 -3630

15 Caballero M，Liton PB，Epstein DL，et al. Proteasome inhibition by chronic oxidative stress in human trabecular meshwork cells［J］. Biochem Biophys Res Commun，2003，22;308(2):346 -352

16 Erb C，Heinke M. Oxidative stress in primary open -angle glaucoma［J］. Front Biosci (Elite Ed)，2011，3:1524 -1533

17 Babizhayev MA，Yegorov YE. Senescent phenotype of trabecular meshwork cells displays biomarkers in primary open-angle glaucoma［J］. Curr Mol Med，2011，11(7):528 -552