熱休克蛋白HSP90α 和miRNA-144 在小鼠腎缺血再灌注損傷后的表達變化

孔曉君 韓俊嶺 高 鑫 李建遠

腎缺血再灌注損傷是一個常見的臨床問題，也是造成急性腎衰竭和移植腎功能延遲恢復的主要原因之一。其損傷機制還未完全明確，主要涉及活性氧的釋放、炎性因子的釋放，細胞凋亡等［1，2］。熱休克蛋白是保護性蛋白家族，構成內源性細胞防御機制來抵抗敵對的環境壓力，在缺氧、缺血、炎癥等壓力刺激下可以誘導表達，按相對分子質量大小主要分為HSP100、HSP90、HSP70、HSP60。HSP90 在多種生物均有表達，在正常情況下占胞質蛋白的1% ～2%，是最豐富的細胞質蛋白之一［3］。真核生物中HSP90 主要有HSP90α、HSP90β 兩種亞型。HSP90α 能夠通過調控各種細胞因子和客戶蛋白的折疊而起到保護細胞的作用。微小RNA(miRNA)為長度18 ～25nt 的非編碼單鏈低分子RNA，能夠在轉錄前水平調控基因的表達，介導靶mRNA 降解或抑制蛋白翻譯［4］。筆者利用生物信息學預測出miRNA - 144 為調控HSP90α 功能的潛在miRNA，然后通過定量RT-PCR和Western blot 法檢測HSP90α 和miRNA -144 在腎缺血再灌注不同時間點的表達情況，初步探討miRNA-144 和HSP90α 在腎缺血再灌注損傷中的調控作用及機制。

材料與方法

1.動物及模型制備:成年雄性昆明白小鼠，體重30 ～40g，由濱州醫學院動物實驗中心提供。隨機分成:①缺血再灌注(IR)組(n=40，每組8 只);②假手術組(n =40，每組8 只)。小鼠用氯胺酮/甲苯噻嗪(80/10mg/kg)腹腔麻醉，充分暴露手術視野固定，乙醇消毒手術部位，腹部正中切口后分離左右腎蒂，用無損傷血管夾夾閉左右腎蒂，肉眼觀察腎臟變黑說明夾閉成功，45min 后松開血管夾，幾分鐘后腎臟變粉紅，說明再灌注成功。假手術組只分離左右腎蒂，不夾閉。IR 組和假手術組分別在術后4、8、12、24、48h 下腔靜脈取血分離血清，取少量腎組織Bouin 氏液固定，用于病理檢查，剩余腎組織于-80℃保存。

2.主要試劑:HE 試劑盒購自碧云天生物技術研究所;RNAiso Plus 購自TaKaRa 公司;ReverTra Ace 反轉錄酶購自Toyobo 公司;Platinum?SYBR?Green qPCR SuperMix - UDG反應試劑盒購自Invitrogen 公司;RIPA 裂解液和BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自煙臺賽爾斯生物技術有限公司;ECL 購自Thermo 公司;HSP90α 抗體和β-actin 抗體購自Santa Cruz 公司;辣根酶標記的山羊抗兔IgG 購自中杉金橋公司;所用引物由上海生工生物工程有限公司合成(表1)。

表1 引物序列

3.生化指標檢測:應用美國德靈Dimension RXL Max 全自動生化分析儀測定血清中肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)水平。

4.組織學評價:小鼠腎組織于Bouin 氏液固定24h，常規石蠟包埋，切片4μm，脫蠟水化后用HE 試劑盒染色，光鏡下觀察腎臟的組織形態變化。

5.miRNA 預測:筆者聯合使用TargetScan(http://www.targetscan. org/)和miRanda (http://www. microrna. org/microrna/home.do)兩個預測軟件同時預測調控HSP90α 功能的潛在的miRNA 分子。取TargetScan 和miRanda 共同預測到的miRNA 即miRNA-144 進行下一步研究。

6.熒光定量RT-PCR:IR 組和假手術組各個時間點的腎組織分別混合后用RNAiso Plus 提取RNA。1μg RNA 用ReverTra Ace 反轉錄酶逆轉。熒光定量PCR 按照Platinum?SYBR?Green qPCR SuperMix -UDG 反應試劑盒的產品說明進行反應，反應體系為:cDNA 1μl，上游引物(10μmol/L)0.6μl，下游引物(10μmol/L)0.6μl，SYBR mix 10μl，dd H2O 8μl。使用Rotor-Gene Q 進行熒光定量PCR 檢測，反應條件為:50℃2min，95℃5min，95℃10s，60℃45s，40 個循環。運用2-△△Ct方法來計算樣本中mRNA 表達水平的差異。所有的實驗重復3 次。△△CT=［Ct(實驗組目標基因)- Ct(實驗組內參基因)］-［Ct(對照組目標基因)- Ct(對照組內參基因)］。mRNA 選用GAPDH 作為內參基因，miRNA 選用U6 作為內參基因。

7.Western blot 法分析:用RIPA 裂解液提取蛋白樣品，BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。電泳轉硝酸纖維素膜上，用HSP90α 抗體(1∶1000)和β-actin 抗體(1∶1500)4℃搖床孵育過夜，清洗。辣根酶標記的山羊抗兔IgG(1∶5000)37℃孵育1h，清洗。ECL 顯色，掃描后，利用Gene Tools image analysis 軟件(Gene Tools，version 4.02;Syngene，Cambridge，UK)測定條帶灰度值，目標條帶與β -actin 的比值作為表達強度。

8.統計學方法:采用SPSS 13.0 統計軟件處理數據，所有數據用均數±標準差(±s)表示，兩組間樣本均數比較采用t檢驗。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1.腎組織形態學變化:HE 染色可見假手術組腎小管排列整齊緊密，而IR 組腎小管排列紊亂，管腔擴張;腎小管上皮細胞扁平，部分腫脹、壞死、脫落，刷狀緣消失;管腔內可見管型;腎間質減少、充血，以再灌注24h 組組織損傷最嚴重(圖1)。

圖1 各組腎組織形態學變化(HE，×400)

2.腎功能指標變化:假手術組和IR 組在再灌注4、8、12、24、48h 后血清中Scr 和BUN 的變化，結果見表2 和表3。與假手術組相比，IR 組的Scr 和BUN 在4h 時開始增高，24h 時達高峰，48h 有所下降，P 均＜0.01 為差異有統計學意義。

表2 小鼠腎缺血再灌注后各組各時相肌酐水平的變化(μmol/L，±s，n=8)

表2 小鼠腎缺血再灌注后各組各時相肌酐水平的變化(μmol/L，±s，n=8)

組別4h 8h 12h 24h 48h假手術組 20.15 ±6.15 21.09 ±5.98 23.78 ±6.78 22.18 ±5.78 23.28 ±4.38 IR 組 75.45 ±8.658 82.95 ±7.64 100.15 ±9.13 153.78 ±6.34 87.13 ±5.35 t 14.73 18.10 18.99 43.39 26.12 P ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

表3 小鼠腎缺血再灌注后各組各時相尿素氮水平的變化(mmol/L，±s，n=8)

表3 小鼠腎缺血再灌注后各組各時相尿素氮水平的變化(mmol/L，±s，n=8)

組別4h 8h 12h 24h 48h假手術組 7.45 ±4.62 8.01 ±6.92 6.78 ±5.73 7.18 ±3.42 7.6 3 ±4.32 IR 組 29.37 ±7.14 34.55 ±7.23 42.16 ±6.04 60.87 ±5.02 39.75 ±6.89 t 7.29 7.50 12.03 25.00 11.17 P ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

3. 腎缺血再灌注后腎組織中HSP90α mRNA 和miRNA-144 的表達變化:缺血再灌注4、8、12、24、48h 時間點的HSP90α mRNA 相對于各自的假手術組表達量分別為1.20 ±0.16、1.81 ±0.16、2.64 ±0.17、2.51 ±0.11、1.66 ±0.17，缺血再灌注組相對假手術組表達明顯升高，且在12h 組表達增加2.64 倍(P ＜0.01)，增加倍數最多，48h 有所降低但仍高于假手術組，差異有統計學意義(P ＜0.01，圖2)。缺血再灌注4、8、12、24、48h 時間點的miRNA -144 相對于各自的假手術組表達量分別為0.45 ±0.08、0.41 ±0.08、0.35 ±0.09、0.29 ±0.07、0.38 ±0.06，與假手術組相比較，IR 組均表達降低，差異有統計學意義(P ＜0.01，圖3)。

圖2 腎缺血再灌注后HSP90α 的mRNA在不同時間點的表達變化

圖3 腎缺血再灌注后miRNA-144在不同時間點的表達變化

4.腎缺血再灌注后腎組織中HSP90α 蛋白的表達變化:HSP90α 蛋白在假手術組及再灌注4、8、12、24、48h 組的相對表達量分別為0.16 ±0.02、0.34 ±0.03、0.45 ±0.03、0.60 ±0.03、0.81 ±0.05、0.46 ±0.05，與假手術組相比，IR 組HSP90α 蛋白水平在缺血再灌注后4h 開始升高，隨著再灌注時間的延長表達逐漸增加，24h 達高峰，48h 有所降低但仍高于假手術組，差異有統計學意義(P 均＜0.01，圖4)。

討 論

圖4 腎缺血再灌注后HSP90α 蛋白在各組表達的Western blot 法檢測結果(A)和平均灰度值(B)

HSP90α，是一組高度保守的細胞內分子伴侶蛋白質，能在環境、生理、化學等各種應激反應下誘導表達，并通過激活各種細胞通路和酶參與重要的細胞功能，如維持細胞結構，參與細胞分化和細胞保護等。研究表明，預先誘導HSP90α 表達增高能保護心肌細胞對抗缺血和化學缺氧損傷，其機制可能與HSP90α的抗氧化和保護線粒體的功能有關［5］。另外，最近幾年miRNA 在組織缺血再灌注損傷方面的研究成為熱點，其中在心肌、肝臟缺血再灌注損傷中的研究較多，而miRNA-144 在腎缺血再灌注損傷中的研究尚未見報道［6，7］。

本實驗采用雙側腎蒂夾閉法建立小鼠腎缺血再灌注損傷模型，研究腎臟中內源性HSP90α 和miRNA-144 的表達變化。實驗發現再灌注4h HSP90α 蛋白和mRNA 表達已開始逐漸增強，mRNA 在12h 達高峰，蛋白水平在24h 達高峰。結合腎組織的病理變化可知HSP90α 的表達是伴隨腎組織損傷程度的加重而逐漸增加的，同時增加的HSP90α 又不斷改善細胞損傷，使腎組織恢復正常。許多體內研究表明HSP90α 表達增高，能對抗一系列應激反應［8，9］。Biermann 等［8］發現H2S 能介導HSP90α 表達增高而在大鼠視網膜缺血再灌注模型中起到保護神經和抗凋亡的作用。Jha 等［9］在小鼠肝缺血再灌注模型中也做了類似的研究，HSP90 表達增高對肝缺血再灌注損傷起到了保護作用。另外，Barrera -Chimal 等［10］在大鼠腎臟中轉染HSP90α，發現HSP90α 過表達能通過刺激內皮一氧化氮途徑，而對大鼠腎缺血再灌注損傷發揮保護作用。從這些研究中，可以看出HSP90在缺血再灌注模型中扮演著重要的角色，能夠減少組織損傷，但潛在的分子機制還有待探討。

miRNA 發揮作用的機制是抑制靶mRNA 分子或蛋白分子的表達。在本實驗中，缺血再灌注組HSP90α 的表達均高于假手術組，因此推測HSP90α對應的潛在miRNA 表達量在缺血再灌注組應該降低，筆者的miRNA -144 實時定量PCR 結果正好與這一推測吻合。所以HSP90α 可能是miRNA -144調控的靶蛋白之一。這也與最近一項研究結果一致，miRNA-144 在心臟缺血再灌注后表達降低［11］。Pan等［6］研究觀察到，miRNA-1 轉基因鼠心臟缺血再灌注模型中，miRNA - 1 表達增高抑制了PKCε 和HSP60 等保護蛋白的表達，使心肌梗死面積增大，加重了心肌損傷。同樣的研究還有miRNA -320 能通過抑制HSP20 的表達而加重心臟缺血再灌注損傷［7］。由此可以推斷，miRNA -144 表達下調是腎組織應對缺血再灌注損傷使HSP90α 表達上調的內源性保護機制，故敲除miRNA-144 可能成為治療腎缺血再灌注損傷的新策略。

綜上所述，HSP90α 表達上調和miRNA -144 表達下調在缺血再灌注中都扮演著重要的角色，對于miRNA-144 是否真正調控HSP90α，筆者將做進一步的研究驗證，從而為臨床上治療腎缺血再灌注損傷提供新的思路和理論基礎。

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