桑葉水提液的急性毒性和遺傳毒性研究

吳友蘋， 張 升

（1.浙江大學醫學院附屬兒童醫院，浙江杭州310003；2.浙江省醫學科學院，浙江杭州310015）

桑葉水提液的急性毒性和遺傳毒性研究

吳友蘋1， 張 升2

（1.浙江大學醫學院附屬兒童醫院，浙江杭州310003；2.浙江省醫學科學院，浙江杭州310015）

目的初步評價桑葉水提液安全性。方法通過小鼠急性毒性試驗、鼠傷寒沙門氏菌試驗 （Ames試驗）、中國倉鼠肺成纖維細胞 （CHL）染色體畸變試驗和小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗，考察桑葉水提液急性毒性和遺傳毒性。結果桑葉水提液40 g/kg小鼠灌胃給藥未出現死亡，體質量與正常對照組比較無明顯差異 （P＞0.05）。經A-mes試驗、CHL細胞染色體畸變試驗、小鼠微核試驗，桑葉水提液的結果均為陰性。結論本實驗條件下，桑葉水提液的小鼠灌胃給藥最大給藥劑量為40 g/kg，且未表現出遺傳毒性。

桑葉水提物；急性毒性；遺傳毒性

桑葉始載于 《神農本草經》，為桑科植物桑Morus alba L.的干燥葉，味甘、苦、性寒，歸肝經；具有疏散風熱、清肺潤燥、清肝明目的功效。據本草綱目記載： “桑葉乃手足陽明之藥，汁煎代茗，能止消渴，明目長發。”現代藥理學研究發現桑葉富含多糖、黃酮等活性成分，有降血壓、抑制血糖上升、抗菌、消炎等功效，具有良好的藥用價值［1-3］。桑葉還是我國目前已批準的既是食品又是藥品的物品原料，但目前有關桑葉的研究報道多為其藥理作用及化學成分分析研究［4-6］，未見其毒理研究報道。我國傳統的中草藥原料有些具有毒性甚至較高毒性，因此對于這類中藥原料的毒性應引起足夠重視。為了解桑葉水提取液安全性，本實驗對其進行了相關毒理學實驗研究，為后續綜合開發利用桑葉資源提供依據。

1 材料

1.1 實驗動物與環境 SPF級ICR小鼠由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，許可證號SCXK（滬）2007-0005，動物合格證號為0037907。小鼠飼養于浙江大學實驗動物中心，許可證號SYXK（浙）2007-0098。環境溫度20.8～23.7℃，相對濕度48.7%～58.9%，壓力33.4～46.8 Pa，換氣次數為＞15次/h，明暗交替12 h/12 h。

1.2 藥物 桑葉購自浙江杭州九洲大藥房，產自廣東，批號110501。取桑葉適量，以10倍體積的水煎煮1 h，提取2次，濾過并將濾液濃縮至相當于生藥量1 g/mL，即得桑葉水提取液（MWE）。進行Ames試驗和細胞試驗前，用孔徑0.22μm一次性濾器過濾，備用。

1.3 試驗菌株和細胞株 組氨酸營養缺陷型鼠傷寒沙門氏菌（TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535）均購自美國Moltox公司。中國倉鼠肺成纖維細胞（CHL）購于中國科學院上海細胞研究所。

1.4 試驗儀器 超低溫冰箱 （702，美國Thermo公司）；高壓滅菌鍋（HVE-50，美國Thermo公司）；液氮罐（Cryosysterm 2000，MVE公司）；超凈工作臺（Nu-425-400E，NUARE）；正置顯微鏡及圖像分析系統 （DM4000/ DM2500/DM1000，德國Leica公司）；倒置顯微鏡（DMIL，德國Leica公司）；二氧化碳培養箱（3111，美國Thermo公司）。

2 方法

2.1 小鼠急性毒性試驗 取符合要求的SPF級ICR小鼠40只，雌雄各半。按體質量隨機分成兩組，每組20只。采用最大給藥量法，設定桑葉水提取液 （1 g/mL）組和蒸餾水對照組，直接灌胃 （ig）給予，灌胃容量為0.4 mL/ 10 g。給藥后連續觀察3 h，后每天觀察1次，連續觀察14 d，記錄小鼠死亡情況及中毒體征，處死并進行尸檢。

2.2 Ames試驗［7-8］采用標準Ames法，2種平板摻入試驗條件 （非代謝活化-S9和代謝活化+S9），TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535為試驗用菌株。根據預試驗結果，設定含有不同桑葉水提取液 （5 000、1 000、200、40、8μg/皿），和蒸餾水陰性對照 （100μL/皿）、標準陽性對照敵克松 （50μg/皿，-S9）、疊氮鈉 （2μg/皿，-S9）、二氨基芴 （20μg/皿，+S9）、環磷酰胺 （200μg/皿，+ S9），分別加入含0.1mL增菌液的2mL頂層培養基中混勻倒入底層培養基上。37℃培養48 h，計算每皿回變菌落數。

2.3 中國倉鼠肺成纖維細胞 （CHL）染色體畸變試驗［9-10］

采用桑葉水提液IC50（2.00 mg/m L）作為染色體畸變試驗的最高試驗質量濃度，以下設1.00、0.50 mg/mL兩個試驗濃度組，同時設定陰性對照組（RPMI1640，0.1 mL/孔）和陽性對照（環磷酰胺50μg/mL，絲裂霉素0.2μg/mL）。在活化 （+S9）條件下各劑量組處理CHL細胞6 h后更換培養液，繼續培養至24 h。在非活化 （-S9）條件下，各劑量組處理CHL細胞6 h，24 h后更換培養液，繼續培養至24 h。終止培養前4 h加10μg/mL秋水仙素溶液。常規消化、收獲CHL細胞。經0.075 mol/L KCl低滲，固定液（甲醇-冰醋酸為3：1）預固定、固定、再固定等步驟后，將細胞滴在預冷的潔凈載玻片上。染色，沖洗，晾干，備鏡檢。

2.4 小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗［11］采用桑葉水提取液40、20、10 g/kg 3個劑量組，同時設陰性對照組 （蒸餾水，40mL/kg）和陽性對照組 （環磷酰胺，50 mg/kg），采用經口灌胃30 h染毒法進行試驗。在0 h、24 h各組均灌胃1次，末次灌胃后6 h，將小鼠頸椎脫臼處死，剪取雙側股骨用小牛血清稀釋涂片，經甲醇固定，Giemsa染色后雙盲閱片。每只小鼠計數2 000個嗜多染紅細胞 （PEC）的微核發生率 （MN‰），同時計數200成熟紅細胞 （RBC）中PEC/RBC值。

2.5 統計學方法 采用SPSS 17.0軟件進行統計分析，各組數據均計算組平均值±標準差，急性毒性試驗和致突變結果采用t檢驗，誘發微核作用和染色體畸變比較采用χ2檢驗。

3 結果

3.1 小鼠急性毒性試驗 給藥后30 min內桑葉水提取液組小鼠主要出現梳理毛發、活動減少和豎毛情況，其他行為活動均正常，給藥后1 h行為活動無明顯異常。蒸餾水對照組小鼠給予蒸餾水30 min后出現豎毛現象，其余活動均正常。觀察期間兩組小鼠均未出現死亡，體質量隨著觀察時間延長而增加。桑葉水提取液組小鼠體質量與蒸餾水組比較無統計學差異 （P＞0.05）。詳見表1。觀察期結束對小鼠進行病理解剖，肉眼觀察心臟、肺臟、腎臟、肝臟、脾臟、胃腸道等均未見明顯異常。試驗結果表明桑葉水提取液最大給藥量為40 g/kg。

表1 桑葉水提液小鼠急性毒性試驗體質量影響 （，n=20）

表1 桑葉水提液小鼠急性毒性試驗體質量影響 （，n=20）

D2 D4 D6 D8 D10 D12 D14蒸餾水對照組組別觀察期小鼠體質量/g 22.5±1.3 25.5±1.5 27.5±2.1 28.7±2.5 29.7±3.0 31.1±3.5 32.1±3.6桑葉水提液組22.6±1.3 25.3±1.9 27.0±2.3 28.2±2.9 29.4±3.4 30.5±3.7 31.7±3.9

3.2 Ames試驗 陽性對照組均顯著增加相應菌株的回變菌落數，與陰性對照組比較有顯著性差異 （P＜0.01），且回復突變菌落數均高于陰性對照組兩倍以上，表明本測試系統符合測試要求。在非活化系統條件下，桑葉水提取液5 000μg/皿、1 000μg/皿和200μg/皿劑量組TA97菌株回變菌落數與陰性對照組比較減少，且有統計學差異 （P＜0.05）。活化代謝條件下，除TA102菌株外，5 000μg/皿劑量組各菌株回復突變數與陰性對照組比較顯著減少（P＜0.05）。未見桑葉水提取液誘發基因回復突變作用，詳見表2。

表2 桑葉水提液Ames試驗結果（）

表2 桑葉水提液Ames試驗結果（）

注：與陰性對照組比較，+表示超過兩倍以上，視為陽性；t檢驗，*P＜0.05，**P＜0.01

TA97 TA98 TA100 TA102 TA1535 5 000（-S9） 10.2±2.1** 2.2±0.5* 16.7±6.5**劑量組別（μg/皿）259.7±9.7 9.7±3.2 1 000（-S9） 89.7±4.9* 5.7±5.1 84.7±5.0 284.3±53.3 10.0±4.0 200（-S9） 86.0±5.6* 11.0±5.0 86.3±3.8 288.3±11.1 8.3±1.5 40（-S9） 106.3±9.1 12.7±3.1 105.3±14.2 266.0±35.4 8.7±3.1 8（-S9） 107.0±6.2 14.0±2.0 106.7±7.6 295.0±24.6 12.0±2.0陽性組（-S9） 1 026.7±47.2**+ 659.3±40.2**+ 650.7±20.0**+ 1 114.0±100.0**+ 585.7±189.4**+陰性組（-S9） 107.0±7.9 16.0±6.6 96.3±17.9 284.3±30.8 14.7±4.2 5 000（+S9） 18±1.7** 9.7±0.2** 42.0±4.6* 188.0±59.0 3.3±1.5*1 000（+S9） 89.3±15.6 18.3±2.2 86.0±25.1 255.0±5.6 7.7±2.5 200（+S9） 99.3±13.7 23.7±4.2 95.3±1.5 275.0±60.7 8.3±3.1 40（+S9） 101.3±6.7 20.7±8.7 89.7±13.3 259.7±17.9 8.7±1.5 8（+S9） 96.7±9.9 23.0±3.6 97.7±15.7 258.3±7.6 9.0±2.6陽性組（+S9） 781.0±102.1**+ 936.3±121.2**+ 644.7±149.5**+ 771.3±88.5**+ 240.3±16.5**+陰性組（+S9）104.7±13.6 16.7±2.5 92.3±22.8 246.0±31.1 9.7±2.5

3.3 CHL細胞染色體畸變試驗 桑葉水提取液高、中、低劑量的中期相染色體結構畸變率均＜5%，與陰性對照組比較無顯著性差異 （P＞0.05）。而陽性對照組，染色體結構畸變率均＞10%，明顯高于陰性對照組 （P＜0.01），顯示陽性結果。因此，在活化和非活化條件下，桑葉水提取液質量濃度小于2 mg/m L對CHL細胞無明顯的染色體畸變作用。詳見表3。

表3 桑葉水提取液對中國倉鼠肺成纖維細胞染色體畸變作用

3.4 小鼠骨髓微核試驗 陽性對照組較蒸餾水對照組微核率顯著增加 （P＜0.01），顯示陽性結果。桑葉水提取各劑量組微核率與蒸餾水對照組比較無顯著性差異 （P＞0.05），表明桑葉水提取劑量小于40 g/kg灌胃對小鼠的微核形成無明顯影響。且各組嗜多染紅細胞與總紅細胞比值（PCE/RBC）范圍處于0.36～0.60間，表明PCE形成正常，試驗結果可靠，詳見表4。

表4 桑葉水提液對小鼠骨髓PCE微核率的影響

4 討論

文獻報道，桑葉水提物對金黃色葡萄球菌（ATCC26001）、金黃色葡萄球菌耐藥株、大腸桿菌（ATCC25—922）、綠膿桿菌 （ATCC10104）、甲型溶血性鏈球菌（ATCC32205）、乙型溶血性鏈球菌（ATCC32210）均有一定的的抗菌作用，且隨著濃度增加，其抑菌率明顯增高［12-14］。本次Ames試驗觀察到桑葉水提取液高劑量組各試驗菌株回復突變菌落數明顯小于自發回變數，提示桑葉水提取液對沙門氏菌有明顯抑制作用，與文獻報道一致［15］。

隨著人們生活水平的提高，糖尿病成為繼心腦血管疾病、癌癥之后危害人類健康的第三大疾病之一。化學藥物降血糖作用較好，但治療并發癥方面有明顯不足，且多易產生不良反應和耐藥性，而天然藥物桑葉不良反應小，在降血糖的同時還可對抗糖尿病并發癥，有著西藥不可替代的綜合優勢和廣闊的應用空間。我國桑樹資源豐富，為預測其對人體潛在的威脅，本實驗從體外到體內，從微生物到離體細胞，再到體細胞對桑葉水提液進行毒性研究。測試體系符合國際標準化要求，試驗結果表明桑葉水提液在本實驗劑量范圍內未見明顯毒性作用，無致突變作用，安全性高，本研究也將為桑葉資源進一步開發利用及臨床安全使用提供科學依據。

［1］Chen JJ，Li X R.Hypolipidemic effect of flavonoids from mulberry leaves in triton WR-1339 induced hyperlipidemic mice［J］.Asia Pac JClin Nutr，2009，16（1）：290-294.

［2］Jaruchotikamol A，Pannangpetch P.Cytoprotective activity of mulberry leaf extract against oxidative stress-induced cellular injury in rats［J］.Pakistan J Pharma Sci，2013，26（1）：163-168.

［3］Chon SU，Kim Y M，Park Y J，et al.Antioxidantand antiproliferative effects of methanol extracts from raw and fermented parts ofmulberry［J］.Eur Food Res Technol，2009，230（2）：231-237.

［4］呂 歡，羅明儷，方 飛，等.桑葉提取物抑制α-葡萄糖苷酶活性體系的優化及動力學研究［J］.中國新藥與臨床藥理，2012，23（1）：42-44.

［5］趙保勝，高曉燕，劉 洋，等，桑葉治療2型糖尿病藥效及其機制研究［J］.中國實驗方劑學雜志，2012，18（20）：263-266.

［6］陳建國，步文磊，王 茵，等.桑葉多糖降血糖作用及其機制研究［J］.中草藥，2011，42（3）：515-520.

［7］黃芳華，王慶利.藥物遺傳毒性研究相關要求進展［J］.中國新藥雜志，2010，19（6）：468-472.

［8］S2B.Guideline for Industry Genotoxicity：A standard battery for genotoxicity testing of pharmaceuticals［S］.ICH，1997.

［9］由振強，蔣春紅，陳 曉，等.喜炎平注射液的遺傳毒性實驗研究［J］.中國臨床藥理學雜志，2013，29（1）：48-50.

［10］劉文斌，楊錄軍，李永紅，等.甲氧化三丁基錫的急性毒性和遺傳毒性研究［J］.癌變·畸變·突變，2012，24（5）：336-339.

［11］474 OECD.Guigeline for the testing of chemicals.mammalian erythrocytemicronucleus test［S］.OECD，1997.

［12］Yan Xiaofen，Yan Huang，Zheng Hanshen，et al.In vitro antibiosis study ofmulberry［J］.JGuangxi Tradi Chin Med Univ，2009，12（3）：48-50.

［13］Wang Hui，Wu Sha，Sun Yifen，etal.An assay on the antiviral activity ofmulberry leafextract［J］.SciSericul，2011，37（5）：0952-0956.

［14］王 輝，吳 莎，孫毅凡，等.桑葉水提取物的抗病毒活性檢測［J］.蠶業科學，2011，37（5）：0952-0956.

［15］杭 濤，姚 磊，李麗萍，等.桑葉提取物抑菌作用的研究［J］.生物學雜志，2005，22（6）：22-25.

R285.5

B

1001-1528（2015）04-0876-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.04.042

2014-02-04

浙江省實驗動物科技計劃 （2011C37097）

吳友蘋 （1982—），女，醫學碩士，藥劑師，主要從事藥物臨床前安全性評價及醫院藥學服務。Tel：（0571）88022520，E-mail：woyaojizu@126.com