煙草綠原酸、蕓香苷、煙堿和茄尼醇的提取技術(shù)研究

李曉芹，杜詠梅*，張懷寶，蒯 雁，劉翠翠，李丹丹

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101；2.大理州煙草公司南澗縣分公司，云南 大理 671000）

我國(guó)是煙草種植大國(guó)，其種植面積居世界首位。目前，煙草農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)施優(yōu)化煙葉結(jié)構(gòu)，致使大量的腳葉與頂葉被廢棄；在卷煙生產(chǎn)過程中，不僅會(huì)產(chǎn)生煙末等煙草廢棄物，同時(shí)還會(huì)有大量可用性差的低次煙葉閑置，難以處理。然而這些煙草廢棄物中含有多種生物活性成分，是一種潛在的資源。煙葉中含有豐富的茄尼醇、綠原酸、蕓香苷和煙堿等生物活性物質(zhì)[1]，他們分別具有不同的生物活性：綠原酸、蕓香苷具有抗氧化、清除自由基活性的作用，可用作食品抗氧化劑[2-4]；茄尼醇是合成輔酶 Q10和維生素 K2的重要中間體[5]；高純度的煙堿可用于生產(chǎn)治療關(guān)節(jié)疼痛和肌肉痙攣的外用藥[6]，煙堿還可以用于生產(chǎn)高效、無殘留的綠色農(nóng)藥。目前，煙葉生物活性物質(zhì)的提取利用已得到廣泛重視，但以前的提取方法一般是以單獨(dú)提取一種或兩種活性物質(zhì)為主。如岑波等[7]、王海燕等[8]、梁金鋒等[9]分別對(duì)煙葉中的茄尼醇、多酚、煙堿進(jìn)行了提取、精制；陳燕梅等[10]、胡海潮等[11]、周新光等[12]對(duì)煙草中茄尼醇和煙堿進(jìn)行了同時(shí)提取；張海波[13]利用不同濃度的乙醇為提取溶劑對(duì)煙葉中的茄尼醇與綠原酸進(jìn)行了分步提取；朱松等[14]將超聲波技術(shù)與酶法相結(jié)合提取煙葉中的綠原酸和煙堿。只有艾心靈等[15]雖然對(duì)煙草中綠原酸、茄尼醇、煙堿進(jìn)行了綜合提取，但存在茄尼醇提取率低、提取溫度高和提取時(shí)間長(zhǎng)等問題。為了實(shí)現(xiàn)煙草中活性物質(zhì)的綜合高效提取，本實(shí)驗(yàn)采用超聲波輔助技術(shù)同時(shí)提取綠原酸、蕓香苷、茄尼醇和煙堿，為煙草中生物活性物質(zhì)的綜合提取、高效利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器為Waters UPLC H-CLASS超高壓液相色譜儀；萬分之一電子天平；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵；KQ-500GVDV型雙拼恒溫?cái)?shù)控超聲波發(fā)生器；TDZ5-WS臺(tái)式低速離心機(jī)。

試劑為乙醇、甲醇、丙酮、NaOH，均為分析純。

1.2 材料的預(yù)處理

煙葉60 ℃烘干，制成40目粉末，4 ℃冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 綠原酸、蕓香苷、茄尼醇、煙堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定方法 綠原酸、蕓香苷的測(cè)定采用YC/T202—2006煙草及煙草制品 多酚類化合物綠原酸、莨菪亭和蕓香苷的測(cè)定。

煙堿的測(cè)定采用YC/T 160—2002煙草及煙草制品 總植物堿的測(cè)定-連續(xù)流動(dòng)法進(jìn)行測(cè)定。

茄尼醇的測(cè)定參照潘葳等[16]制訂的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。

1.3.2 提取方法 稱取15 g煙末置于提取器中，加入150 mL提取溶液，混勻，40 ℃超聲提取20 min，抽濾，濾液放入500 mL容量瓶中；殘?jiān)^續(xù)按照以上步驟提取2次，時(shí)間為10 min，3次提取液合并，以水定容至500 mL。

1.3.3 計(jì)算方法 按 1.3.1所列方法分別測(cè)定提取液與煙末中的綠原酸、蕓香苷、煙堿和茄尼醇并計(jì)算提取率。

2 結(jié) 果

2.1 有機(jī)溶劑種類和濃度對(duì)綠原酸、蕓香苷、煙堿和茄尼醇提取率的影響

以不同濃度的乙醇、甲醇、丙酮為提取溶劑，按照 1.3.2中的提取方法進(jìn)行綠原酸、蕓香苷、煙堿和茄尼醇的提取、測(cè)定并計(jì)算提取率。

2.1.1 綠原酸 隨著濃度的增大，乙醇、甲醇、丙酮3種溶劑對(duì)綠原酸的提取率均是先增高后降低；3種溶劑的濃度在 40%~80%時(shí)，提取率均達(dá)到93.3%以上；濃度在 80%~100%時(shí)，綠原酸的提取率急劇下降，下降程度按甲醇、乙醇、丙酮依次增強(qiáng)（圖1）。

圖1 溶劑濃度對(duì)煙草綠原酸提取率的影響Fig.1 The effects of solvent concentration on tobacco chlorogenic acid extraction rate

2.1.2 蕓香苷 隨著濃度的增大，乙醇與丙酮兩種溶劑對(duì)蕓香苷的提取率均是先增高后降低；兩種溶劑的濃度在 40%~80%時(shí)，提取率均達(dá)到 93.9%以上；濃度在95%~100%的范圍內(nèi)，蕓香苷的提取率急劇下降且丙酮較乙醇下降程度更大，而當(dāng)甲醇濃度在20%~100%的范圍內(nèi)，蕓香苷提取率均較高（圖2）。

圖2 溶劑濃度對(duì)煙草蕓香苷提取率的影響Fig.2 The effects of solvent concentration on tobacco rutin extraction rate

2.1.3 煙堿 隨著濃度的增大，乙醇與丙酮兩種溶劑對(duì)煙堿的提取率均是先增高后降低；兩種溶劑的濃度在40%~80%時(shí)，提取率均達(dá)到96.7%以上；濃度在95%~100%的范圍內(nèi)，煙堿的提取率急劇下降且丙酮較乙醇下降程度更大，而當(dāng)甲醇濃度在20%~100%的范圍內(nèi)，煙堿提取率均較高（圖3）。

2.1.4 茄尼醇 有機(jī)溶劑濃度在0~60%時(shí)，乙醇、甲醇與丙酮 3種溶劑對(duì)茄尼醇的提取率均為 0；3種溶劑的濃度在80%~100%時(shí)，乙醇與丙酮對(duì)茄尼醇的提取率均是先增高后降低，而甲醇對(duì)茄尼醇的提取率逐漸升高，但甲醇與丙酮對(duì)茄尼醇的提取率均較乙醇低（圖4）。

綜合以上結(jié)果，3種溶劑的濃度在 60%~80%時(shí)，綠原酸、蕓香苷、煙堿均能達(dá)到較好的提取效果；而茄尼醇在3種溶劑的濃度低于60%時(shí)，幾乎不被提取；隨著濃度從60%增加到95%，提取效率也逐漸升高；不同溶劑對(duì)茄尼醇的提取率差異較大，乙醇的提取效果最佳，在濃度為95%時(shí)提取率達(dá)到最高。鑒于此，為了實(shí)現(xiàn)4種物質(zhì)的高效綜合提取，選擇濃度為80%和95%的乙醇溶液進(jìn)行組合提取。

圖3 溶劑濃度對(duì)煙草煙堿提取率的影響Fig.3 The effects of solvent concentration on nicotine extraction rate

圖4 溶劑濃度對(duì)煙草茄尼醇提取率的影響Fig.4 The effects of solvent concentration on tobacco solanesol extraction rate

2.2 不同濃度乙醇溶液組合提取效果

將 80%與 95%的乙醇溶液進(jìn)行不同組合（表1~4），分3次提取煙草中的4種活性成分，并測(cè)定提取液中綠原酸、蕓香苷、煙堿及茄尼醇，計(jì)算 4種活性成分的提取率并進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表1~4。

由表1~4可以得出，用80%、95%、80%的乙醇溶液和 80%、80%、95%乙醇溶液組合進(jìn)行綜合提取，綠原酸、蕓香苷、煙堿和茄尼醇的提取率均達(dá)到99.75%以上，且兩種組合的方差分析結(jié)果無顯著差異，因此兩種組合均可作為煙草中4種活性成分的綜合提取溶劑。

表1 不同乙醇溶液組合煙草綠原酸提取率Table 1 The chlorogenic acid extraction rate of different ethanol solution combinations

表2 不同乙醇溶液組合煙草蕓香苷提取率Table 2 The rutin extraction rate of different ethanol solution combinations

表3 不同乙醇溶液組合煙堿提取率Table 3 The nicotine extraction rate of different ethanol solution combinations

表4 不同乙醇溶液組合煙草茄尼醇提取率Table 4 The solanesol extraction rate of different ethanol solution combinations

3 討 論

從不同濃度的溶劑對(duì)茄尼醇提取率影響的結(jié)果可以看出，與甲醇、丙酮相比，高濃度的乙醇對(duì)茄尼醇的提取率最高，且低濃度乙醇對(duì)綠原酸、蕓香苷、煙堿的提取率均較高，因此選擇乙醇為最佳的綜合提取溶劑。本實(shí)驗(yàn)選擇80%與95%的乙醇溶液進(jìn)行綜合提取，主要因?yàn)榫G原酸、蕓香苷、煙堿、茄尼醇4種成分的極性差異，茄尼醇為弱極性物質(zhì)，在高濃度乙醇中的溶解性較高，綠原酸、蕓香苷與煙堿為極性物質(zhì)，在低濃度乙醇中的溶解性較高，因此采用80%的乙醇溶液與95%的乙醇溶液進(jìn)行組合提取。艾心靈等[15]用單一溶劑95%乙醇進(jìn)行綜合提取，得到綠原酸、煙堿和茄尼醇等3種成分的提取率分別為93.65%、95.42%和82.35%，其中茄尼醇的提取率較低，且提取溫度較高（80 ℃），提取時(shí)間長(zhǎng)（90 min），而本實(shí)驗(yàn)采用80%、95%、80%和 80%、80%、95%乙醇溶液組合對(duì)煙草中的綠原酸、蕓香苷、煙堿和茄尼醇4種成分進(jìn)行提取，同時(shí)用超聲波輔助提取，使活性成分快速分散到溶劑中，縮短了提取時(shí)間，最終實(shí)現(xiàn)了4種物質(zhì)的綜合高效率提取，提取率均達(dá)99.75%以上，且與其他兩種溶劑相比，不僅無毒且成本低，使煙草中的活性成分適宜作為食品級(jí)原料的工業(yè)化生產(chǎn)。

4 結(jié) 論

通過本研究得出，以超聲波為輔助手段，煙末樣品在料液比1:10，提取溫度40 ℃，依次以80%、95%、80%的乙醇溶液或80%、80%、95%乙醇溶液組合為提取溶劑提取3次，提取時(shí)間依次為20、10、10 min的條件下，煙草綠原酸、蕓香苷、煙堿、茄尼醇的提取率均達(dá)99.75%以上，該方法適用于煙草中綠原酸、蕓香苷、煙堿和茄尼醇的綜合提取。

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