降逆護(hù)膜湯對DCA誘導(dǎo)食管黏膜上皮細(xì)胞凋亡中p38MARK信號通路的影響

黃啟婷，董 筠

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，南京210029)

胃食管反流病(GERD)是指因食管胃連接處防反流機(jī)制障礙而導(dǎo)致胃或腸內(nèi)容物反流入食管，從而引起食管炎癥的疾病［1］。近幾年研究［2-3］發(fā)現(xiàn)，膽鹽被認(rèn)為是胃食管反流病中造成食管損害的主要物質(zhì)之一，脫氧膽酸(Deoxycholic acid，DCA)作為膽汁的重要成分，長時間的作用可引起凋亡改變。p38MAPK是細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，調(diào)控多種基因的表達(dá)，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及介導(dǎo)炎癥、應(yīng)激等多種生理、病理過程［4］。本課題組前期研究［5-6］發(fā)現(xiàn)，降逆護(hù)膜湯對胃食管反流病有良好的防治作用。本研究旨在探討降逆護(hù)膜湯治療胃食管反流病的機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 降逆護(hù)膜湯(黃連3 g，吳茱萸2 g，黨參10 g，旋覆花5 g，赭石20 g，黃芩6 g，烏賊骨20 g，大貝母 10 g，仙鶴草 15 g，白及6 g，炒枳殼 10 g，厚樸10 g)共117 g，用1170 mL蒸餾水加熱回流提取2次，每次60 min，合并提取的藥液，用三蒸水稀釋成濃度為100 mg/mL，滅菌備用。

1.2 試劑與設(shè)備 RPMI-1640培養(yǎng)液(凱基生物);胎牛血清(杭州四季青);胰蛋白酶(Gibco公司);SB203580(selleck公司);脫氧膽酸(DCA)(sigma公司);鼠抗人β-actin單抗(sigma公司);兔抗人P38單抗(Cell Signalin g公司);兔抗人p-P38單抗(Cell Signaling公司);兔抗人 Bax單抗(Cell Signaling公司);鼠抗人Bcl-2單抗(santa cruz公司);山羊抗鼠多克隆抗體(北京中杉生物技術(shù)公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人正常食管黏膜上皮細(xì)胞HEEC(購自上海雷蒂生物科技發(fā)展有限公司)。用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2、完全飽和濕度下常規(guī)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

2.2 MTT法測定細(xì)胞生存率 觀察DCA誘導(dǎo)HEEC凋亡的變化以及降逆護(hù)膜湯對其的影響。實(shí)驗(yàn)分為:空白對照組，DCA組，降逆護(hù)膜湯1－5組(5個濃度梯度 2、4、6、8、10 g/L)。以每孔 200 μL 含 1萬個細(xì)胞的細(xì)胞懸液接種于96孔板，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，貼壁后降逆護(hù)膜各組同時加入不同濃度的水提液培養(yǎng)24 h，其余2組不予特殊處理。DCA組和降逆護(hù)膜湯組加入濃度為500 μmol/L的 DCA處理24 h。根據(jù)MTT常規(guī)方法操作，通過酶標(biāo)儀測波長490 nm下的吸光度值。

2.3 Western Blot法測定相關(guān)蛋白的表達(dá) 以50萬個細(xì)胞的細(xì)胞懸液接種于大皿上，細(xì)胞培養(yǎng)及給藥同上，中藥分為小劑量組，中劑量組，大劑量組，濃度分別為4，6，8 g/L進(jìn)行試驗(yàn)。新增 SB203580組，于DCA處理前加入10 μmol/L的SB203580預(yù)處理1 h，其余步驟同前。DCA處理24 h后棄培養(yǎng)液，PBS洗2次，加含磷酸化蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，冰上裂解15 min，用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，4℃下12 000 r/min，離心15 min，取離心后的上清，采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量。取20 μg蛋白上樣到12%SDS-PAGE凝膠，電泳。將凝膠上的蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%BSA封閉1 h，將一抗用5%BSA稀釋(兔抗人P38單抗1∶1 000，兔抗人 p-P38單抗，1∶1 000，鼠抗人β-actin單抗，1∶16 000，兔抗人Bax單抗，1∶1 000，鼠抗人Bcl-2單抗1∶500)，將膜與一抗置于封閉的塑料袋中，4℃冰箱孵化過夜。取出PVDF膜，PBST洗3次，加入1∶2 000配制的二抗(山羊抗鼠多克隆抗體，山羊抗兔多克隆抗體)，室溫?fù)u床上孵化1 h，PBST洗膜3次，配制BeyoECL Plus工作液(A液和B液等比例混合)，使工作液充分覆蓋膜上，放置1～2 min，在X線膠片上曝光、顯影、定影、拍照。

3 結(jié)果

3.1 降逆護(hù)膜湯對細(xì)胞生存率的影響 見表1。

表1 MTT檢測DCA與降逆護(hù)膜湯對HEEC生存率的影響(±s，n=3)

表1 MTT檢測DCA與降逆護(hù)膜湯對HEEC生存率的影響(±s，n=3)

注:與DCA組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

均值空白組 0 1.088±0.033組 別 劑量/(g/L)OD##DCA組 0 0.769±0.082降逆護(hù)膜湯1組 2 0.773±0.111降逆護(hù)膜湯2組 4 0.880±0.046#降逆護(hù)膜湯3組 6 0.945±0.074##降逆護(hù)膜湯4組 8 1.018±0.065##降逆護(hù)膜湯5組 10 1.107±0.064##

3.2 降逆護(hù)膜湯對P38(40KD)和p-P38(43KD)表達(dá)的影響 蛋白表達(dá)量檢測結(jié)果顯示，DCA組p-P38表達(dá)量明顯高于空白對照組(P＜0.05)，而通道抑制劑SB203580組則與空白對照組無明顯差異，結(jié)果提示，降逆護(hù)膜湯能明顯抑制P38的磷酸化，并且隨著濃度增加，抑制效果越明顯(見圖1)。

3.3 降逆護(hù)膜湯對Bax(20KD)和Bcl-2(26KD)表達(dá)的影響 蛋白表達(dá)量檢測結(jié)果顯示，細(xì)胞內(nèi)Bcl-2/Bax表達(dá)量比值，與空白組比較，DCA組明顯減小(P＜0.05)，表明500 μmol/L的DCA可促使細(xì)胞表達(dá)凋亡蛋白。通道抑制劑SB203580組無明顯差異，表明阻斷p38MARK通路可有效阻斷DCA誘導(dǎo)凋亡。同時，降逆護(hù)膜湯3個濃度組中Bcl-2/Bax比值均現(xiàn)升高趨勢，呈濃度依賴性。與DCA組比較，降逆護(hù)膜湯4組(8 g/L)明顯升高(P＜0.05)。由此提示降逆護(hù)膜湯能促進(jìn)凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，抑制促凋亡蛋白Bax表達(dá)，進(jìn)而抑制DCA引起的細(xì)胞凋亡(見圖2)。

圖1 各組食管上皮細(xì)胞中P38和p-P38的蛋白表達(dá)情況

圖2 各組食管上皮細(xì)胞中Bax和Bcl-2的蛋白表達(dá)情況

4 討論

降逆護(hù)膜湯是董筠老師對于胃食管反流病證屬肝胃郁熱者所擬定的經(jīng)驗(yàn)方，具有修復(fù)食管破損黏膜，預(yù)防Barrett食管、食管腺癌的發(fā)生，有效緩解癥狀，提高患者生活質(zhì)量等作用［7］。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，膽鹽在反流性食管病中造成食管損害不可忽視。膽鹽能不同程度的引起培養(yǎng)的食管上皮細(xì)胞凋亡［8］。膽酸短時間刺激可產(chǎn)生增殖效應(yīng)，而長時間作用可引起凋亡改變，DCA較其他膽酸對細(xì)胞的毒性作用更大［3］。細(xì)胞凋亡是胃腸道黏膜細(xì)胞丟失的重要途徑，胃腸道黏膜細(xì)胞凋亡異常導(dǎo)致了胃腸道疾病的發(fā)生與發(fā)展［9］。p38MARK是一條重要的信號通路，是一組細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，在炎癥、細(xì)胞生長、凋亡等過程中均發(fā)揮重要的調(diào)控作用，能被多種細(xì)胞外的刺激因素激活。p38MARK通過TGY位點(diǎn)中蘇氨酸和絡(luò)氨酸的磷酸化而活化，活化的p38MARK進(jìn)一步活化下游的蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控多種基因的表達(dá)［10］。韋金英等［11］研究發(fā)現(xiàn)，用SB203580阻斷p38MARK通路能夠抑制細(xì)胞凋亡和提高Bcl-2/Bax的比例。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，用p38MARK特異性抑制劑SB203580阻斷信號通路可明顯抑制DCA引起的凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，說明p38MARK是DCA誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制之一。

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