心肌球樣細胞的生物來源及治療心力衰竭潛在作用的實驗研究

聶良明 張慧 王曉明 許林海

心肌球樣細胞的生物來源及治療心力衰竭潛在作用的實驗研究

聶良明 張慧 王曉明 許林海

目的 探討心肌球樣細胞（CDCs）在心力衰竭治療中的應用前景。方法 Wistar雄性大鼠24只，無菌下取大鼠心臟組織通過膠原酶消化，培養取得CDCs，采用體外培養連續傳代（P1～P5），鏡下觀察可見CDCs團形成。采用流式細胞儀分析細胞表型，并連續觀察CDCs的自我更新和心肌細胞分化能力，并用免疫組化檢測CDCs中的肌鈣蛋白（cTnT）的表達。結果CDCs體外呈指數生長并形成細胞團樣結構，流式細胞儀檢測顯示：CD29、CD44、CD90和CD106為陽性，而CD34、CD45為陰性。CDCs表達了心肌細胞特異性的結構蛋白cTnT，并可在體外培養條件下產生自主搏動。結論 CDCs是具有心肌細胞分化潛能及臨床應用前景的細胞供體。

心肌球樣細胞（CDSs） 細胞治療 心力衰竭

心力衰竭病死率很高，現有的醫療手段雖然可以有效改善心臟功能，但仍不能防止病情的進一步惡化。心力衰竭的治療除了心臟移植以外，其他手段無法補償缺失的功能性心肌[1]。盡管心臟本身具有自我更新和修復的能力，但這種內源性的修復能力不足以代償諸如心肌大面積壞死引起的心肌細胞喪失[2]。心源性干細胞（cardiac stem cells，CSCs）與心臟組織相容性良好，因此可以更好地整合到心肌組織當中[3]。對此，我們在臨床開展心臟移植的基礎上，進一步通過動物實驗，從細胞供體的角度，研究心肌球樣細胞（cardiospherederived cells，CDCs）的干細胞生物學特性以及其在體外擴增以后的更新能力和心肌細胞分化潛能，探討CDCs作為細胞供體用于治療心力衰竭的可能，現將實驗結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 （1）實驗動物：Wistar雄性大鼠24只，體重200～300g，由浙江中醫藥大學實驗動物中心提供。（2）麻醉藥品和抗凝藥：異氟烷，鹽酸氯胺酮，氟哌利多、萬可松、肝素鈉（美國Sigma公司）。（3）實驗試劑：小鼠抗肌鈣蛋白（cTnT）多克隆抗體、兔抗c-kit和cTnT多克隆抗體（均由美國Santa Cruz公司）；TRITC和FITC標記的羊抗兔抗血清（德國Dako公司）。（4）手術器材和實驗儀器：手術顯微鏡（鎮江中天公司，XTS-4A型），冷凍切片機（德國Microm公司，HM315R型），熒光顯微鏡（日本Olympus公司，IX71型）。

1.2 免疫組化檢測 CO2窒息法處死動物，開胸取心臟清洗后用組織包埋液在-40～-30℃速凍成組織包塊，快速切片，厚度7μm。1%冷多聚甲醛固定后，分別作HE染色和間接免疫熒光染色。免疫組化檢測切片先用羊血清封閉30min，加入一抗（抗c-kit）置側擺搖床室溫下孵育2h，然后用PBS洗去一抗，洗滌3次后加入二抗并孵育1h，最后4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色看到標記細胞核，洗滌后用Fluormount封片，熒光顯微鏡數碼成像。

1.3 CDCs的分離、培養 CO2窒息法處死大鼠，75%乙醇浸泡3min。無菌操作下剪開大鼠腹部；沿肋骨邊緣將隔膜小心剪開，打開胸腔。取出心臟清洗后，將心肌組織充分剪碎，再用PBS洗去脂肪滴，加入3倍體積的膠原酶，吹勻后轉移到15ml的離心管中；37℃水浴中消化30min（每隔5min取出充分搖勻），100目濾網過濾；FicollR400梯度離心，棄上清液，用基礎培養液（低糖DMEM培養液、30%胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素、2mmol/L谷氨酰胺，pH 7.2）重懸細胞，接種到T25培養瓶中；第3天進行觀察換液，棄未貼壁細胞，之后換液1次/3d；細胞鋪滿瓶底70%～80%時，用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA，0.04ml/cm2）消化后傳代，傳代比例為1∶3，標記為第一代細胞（P1），之后換液1次/3d，細胞近單層融合時傳代，分別標記為Pn（n=1、2、3……）。

1.4 CDCs的自我更新能力測定 取分離的原代細胞，通過體外連續傳代，分析觀察傳代細胞形成克隆樣結構的數目，以此表明其自我更新能力，培養傳代。

1.5 流式細胞儀檢測CDCs表面標記 取P3細胞，待細胞生長至90%鋪滿時，用0.25%胰蛋白酶消化分離，離心后用PBS重懸細胞，調整細胞密度為3.0×106/ml。根據需要，將100μl細胞懸液分裝于2ml離心管，并按量于各個樣品管內加入相對應的抗體，包括：CD29、CD34、CD44、CD45、CD90、CD105（1∶100～200稀釋）。4℃避光孵育30min后，于每樣品管內添加2ml PBS，離心后棄上清液，分離游離抗體。最后，每樣品管加入500μl PBS，重懸細胞，上機檢測。

1.6 CDCs中cTnT表達測定 將P3的CDCs接種于細胞培養玻片中，3d后作免疫組化染色。培養玻片先抽去培養液，用1%冷多聚甲醛固定后用羊血清封閉30min，加入一抗（cTnT）置側擺搖床室溫下孵育2h，然后用PBS洗去一抗，洗滌3次后加入二抗并孵育1h，最后作DAPI染色，洗滌后用Fluormount封片，熒光顯微鏡下數碼成像。

2 結果

2.1 大鼠心臟組織免疫組化檢測結果 見圖1。

圖1 大鼠心臟組織免疫組化檢測結果（圖中箭頭示c-kit陽性細胞，右下標記示100μm）。

由圖1可見，大鼠心肌組織中部分間質細胞呈ckit陽性染色，以c-kit為特征的陽性細胞普遍存在于大鼠心肌組織中，提示成年大鼠心臟中富含c-kit陽性為特征的CSCs。

2.2 CDCs的培養和自我更新能力 見圖2。

圖2 CDCs傳代培養結果（圖中箭頭示c-kit陽性細胞，左下標記示100μm）。

由圖2所見，觀察傳代后CDCs的形態和形成心肌球樣結構的能力，結果顯示，CDCs在反復傳代以后，分離培養的CDCs在體外連續傳代至P5，同樣可以形成心肌球樣結構，大約每低倍視野（×10）中（6.82± 2.96）個細胞團，表明CDCs具有連續自我更新能力。

2.3 流式細胞儀分析結果 見圖3。

由圖3可見，CDCs體外培養3代后，CD29、CD44、CD90、CD105陽性，CD34、CD45陰性，表明分離的細胞具有間充質干細胞的特征。

2.4 CDCs免疫組化分析結果 見圖4。

由圖4可見，用免疫組化的方法檢測傳代后的CDCs（P5），發現傳代以后的CDCs在常規的培養條件下，細胞團中心的部分細胞已經呈cTnT陽性染色（圖4A），并可以分化成自主搏動的細胞（圖4B）。cTnT是心肌細胞特異性的結構蛋白，僅表達于成熟心肌和心肌前體細胞。CDCs呈cTnT陽性染色，表明CDCs是心肌細胞的前體細胞，具有比較強的分化成成熟心肌細胞潛能。

圖3 流式細胞儀分析結果

圖4 CDCs免疫組化分析結果（A：藍色為DAPI細胞核染色；B：箭頭所指分化成自主搏動的細胞；左下標示為100μm。）

3 討論

心力衰竭目前有效的治療手段為心臟移植，但由于心臟供體的短缺，心臟移植的大規模臨床應用在很大程度上受到了限制。再生醫學研究的科學家們目前正在致力于細胞移植技術，修復和改善由于心肌損傷后的心功能不良[2]。最近研究表明，心臟本身具有自我更新和修復能力，其再生和修復過程與內源性的CSCs有關[4]。但這種內源性的修復能力不足以代償諸如心肌大面積壞死引起的心肌細胞喪失[2]。目前，科學家們正在探究如何刺激心臟本身的內源性的修復能力，促進損傷心肌的修復和再生。

干細胞是指還沒有完全發育為成體細胞、具有演變成特定器官潛力的細胞。由于心肌細胞是終末分化細胞，無法進入細胞周期，缺乏自我更新能力[5]。近十年來，隨著干細胞定向心肌細胞分化技術的成熟，通過心肌成形術手段修復損傷心肌成為治療缺血性心臟病最有前景的治療方法之一[2]。然而，細胞供體的選擇很大程度上直接影響到細胞治療的質量。早期開展的胚胎干細胞和最近發現的誘導的多能干細胞由于其倫理學問題和分化成畸胎瘤的危險性以及這些細胞的免疫排斥反應，很大程度上制約了進一步的臨床應用[5]。目前正在實施的干細胞治療缺血性心臟病的臨床試驗，主要采用自體的骨髓干細胞和脂肪干細胞。多中心的Meta分析顯示，細胞治療僅有微弱心功能改善效果，其主要問題是這些非心源性成體干細胞在心臟中的低成活率[6]。因此，選擇合適的供體細胞來源，直接影響到細胞治療的臨床療效。

CDCs可能是心血管系統在胚胎發育過程中第二心區殘留的特殊細胞群，是一種特殊的CSCs。心臟第二心區的細胞主要來源于流出道附近，進一步遷移至室間隔和心室表層，發育成心外膜，冠脈系統和部分心外膜下心肌[3，7]。當心臟發育成熟以后，這些細胞可以會繼續存在于成體心臟的細胞間質中。因為CDCs代表了心臟組織的內源性的修復和再生能力，當心肌損傷時，CDCs可能參與心機損傷以后的自我更新和修復作用。因此，通過體外擴增手段，就可以放大心臟的修復能力，通過細胞移植技術，補充缺失的心肌細胞，改善心功能[2]。我們通過消化分離CDCs，并用流式細胞儀分析這些細胞的的免疫表型，發現CDCs與機體的其他組織的骨髓基質細胞（MSC）有很大的類似，比如，CDC和MSC都是CD90和CD105陽性細胞群，CDCs并不是一種單一的細胞群，同時也可能是c-kit陽性，也可能是sca-1和flk-1陽性細胞。利用這些細胞表面的標記蛋白，可以成功分離和純化心肌組織中的CDCs[8]。Chong等[9]在2011年進一步實驗證明了確定CDCs是心臟固有的干細胞，并可以形成成纖維細胞樣克隆樣結構（CFU-FS），并具有多向分化的細胞潛能。

自從CDCs被發現以來，其心源性和組織兼容性受到了廣泛的重視，并已經開展了大量的動物實驗研究[10-12]。由于CDCs是心臟組織中特有的間質干細胞，因此，CDCs的自我更新能力是體外培養擴增的必要前提。我們的實驗結果表明，從心臟組織活檢標本中獲得的CDCs可以在體外連續傳代，并具有自我更新能力（形成CDCs細胞團）。這一生物學特征，可以滿足將來臨床應用的條件，即從小塊心肌活檢組織中分離心臟干細胞，并在體外擴增至臨床治療的數量級的細胞數（大約108個細胞）。最主要的是，CDCs經過連續傳代以后，其心肌細胞的分化潛能并沒有改變。因此，結合以往的在體實驗結果，本實驗為將來利用CDCs治療缺血性心臟病和心力衰竭提供了實驗基礎。動物實驗的研究結果同時推動了CDCs的進一步臨床研究，目前《Lancet》雜志分別發表了兩項評估自體CDCs冠狀動脈內注射的可行性和安全性研究成果（代號分別為SCIPIO和CADUCEUS）[10，13]。美國加州和肯塔基州的兩個研究團隊分別通過導管技術獲得患者的心房和心室的組織標本，通過體外分離培養，獲得純化的CDCs細胞，并進一步擴增后，再注射到患者的梗死心肌區域（其中SCIPIO有16例患者，CADUCEUS有17例患者）。研究結果顯示，CDCs細胞移植可以減少心肌梗死以后的瘢痕形成，改善心臟的收縮功能。但是由于這些研究都是小樣本并缺乏有效的對照患者，所以，CDCs的臨床研究需要大樣本和多中心的進一步研究。

CDCs可以從心臟組織活檢標本中獲得，可以準備患者特異性的干細胞供體，減少免疫排斥反應。由于CDCs具有自我更新能力，可以在體外擴增至臨床應用的數量級的細胞數。同時，CDCs具有較其他來源的干細胞（例如骨髓干細胞和脂肪干細胞）擁有更好的心臟組織相容性。因此，CDCs是一種非常有實際臨床意義的細胞供體來源；不過，治療心力衰竭的臨床療效仍然需要進一步的研究。

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Biological origin of cardiosphere-derived cells and their therapeutic potential for heart failure

NIE Liangming,ZHANG Hui,WANG Xiaoming,et al.
Department of Cardiothoracic Surgery,Zhejiang Provincial People's Hospital,Hangzhou 310014,China

【 Abstract】 Objective To investigate the differentiation potential of cardiosphere-derived cells(CDCs)after expansion in vitro.Methods CSCs were isolated by enzymatic digestion of cardiac issue from 24 Wistar rats and their immunological phenotypes were analyzed by using FACS and immunohistological staining.After expansion up to 5th passage,the ability of self-renewal and myogenic potential were analysed. Results The isolated cardiac stem cells(CSCs) grew exponentially and exhibited a similar morphology to cardiosphere.FACS analysis revealed positive for CD29,CD44, CD90,CD106and negative for CD34,CD45.Small fractions of CSCs were undergoing myogenic differentiation,evidenced by the expression of cardiac structural proteins(cTnT)and developing spontaneous contraction. Conclusion CDCs retain myogenic potential after in vitro expansion and thus may be used as donor cells for cardiac plasticity.

Cardiosphere-derived cells Cell therapy Heart failure

2014-09-02）

（本文編輯：楊麗）

浙江省醫藥衛生科技計劃項目（2013KYA021）

310014 杭州，浙江省人民醫院心胸外科（聶良明、許林海），手術室（張慧）；南京明基醫院心胸外科（王曉明）