Livin shRNA表達載體的構建及在胰腺癌細胞的效應研究

張財明 季一鳴 朱敏 呂尚東 王愛東

Livin shRNA表達載體的構建及在胰腺癌細胞的效應研究

張財明 季一鳴 朱敏 呂尚東 王愛東

目的 構建Livin shRNA真核表達載體，探討干擾質粒穩定轉染的胰腺癌panc-1細胞系效應。方法 合成Livin基因干擾序列并定向插入到RNA干擾（RNAi）真核表達載體pGCsilencerTM U6/Neo/GFP/RNAi質粒，通過測序進行鑒定。干擾質粒經脂質體Lipofectamine 2000介導轉染panc-1細胞。經G418持續壓力選擇和有限稀釋法獲得穩定轉染的細胞系。定量RT-PCR檢測所篩選克隆Livin mRNA的轉錄水平，采用western blot驗證Livin蛋白表達水平改變。結果 測序證明Livin干擾序列及讀碼框正確，干擾質粒穩定轉染的panc-1細胞在倒置熒光顯微鏡下呈明亮綠色熒光，定量RT-PCR和western blot檢測結果顯示Livin shRNA序列對胰腺癌細胞系Livin mRNA及蛋白表達均有抑制作用。結論 成功構建Livin shRNA真核表達載體，建立Livin shRNA質粒穩定轉染的panc-1細胞系可為進一步研究Livin在胰腺癌細胞中的作用奠定基礎。

Livin基因 RNA干擾 轉染 panc-1細胞

Livin基因又名KIAP/ML-IAP基因，定位于染色體20q13.3，是一個新近發現的凋亡抑制基因（inhibitor of apoptosis protein，IAP），屬于IAP家族中一個重要的成員，其意義接近于survivin基因，其在腫瘤細胞抗凋亡機制和耐藥機制的形成中都有重要意義。本研究探討Livin shRNA序列對胰腺癌細胞系中Livin基因的抑制作用，為以Livin基因為靶點的腫瘤基因治療提供實驗依據，現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 小干擾（siRNA）干擾片段和引物由捷瑞公司（上海）合成，限制性內切酶SalⅠ、BamHⅠ和HindⅢ、T4 DNA連接酶、脂質體Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司，pGCsilencerTM U6/Neo/GFP/RNA干擾（RNAi）載體購自Promega公司，無內毒素質粒抽提試劑盒購自OMEGA公司、Livin多克隆抗體購自GeneTex公司，GAPDH為杭州賢至生物公司產品，ECL prime為美國GE公司產品。

1.2 方法

1.2.1 shRNA設計和重組體的構建 根據GenBank數據庫Livin基因序列（NM-022161），參考siRNA的設計原則（siRNA的結構為BamHI+sense+Loop+Antisense+終止信號+HindⅢ）。設計Livin RNAi打靶序列3條，其中Livin-1為5′-CAGGCCATCAGGACAAGGT-3′；Livin-2為5′-GGAAGAGACTTTGTCCACA-3′；Livin-3為5′-GGAGAGAGGTCCAGTCTGA-3′。在sense與antisense序列中間為9個插入序列TTCAAGAGA，形成發夾環，并在寡核苷酸片段的5′和3′端引入BamHⅠ和HindⅢ酶切位點，使其能與pGCsilencerTM U6/ Neo/GFP/RNAi載體連接。用30μl退火溶液溶解合成的2 OD DNA單鏈合成片段，94℃水浴退火，自然冷卻至室溫。1%瓊脂糖凝膠回收大片段，稀釋退火片段Livin，分別與線形化pGCsilencerTM U6/Neo/GFP/RNAi質粒表達載體連接。各取5μl過夜連接產物轉化感受態細胞DH5a，分別涂布于含氨芐抗性（終濃度為100ng/μl）的LB平板上，37℃恒溫箱培養過夜。從每個培養皿上各挑取3個單克隆菌落接種于3ml含氨芐抗性（終濃度為100ng/μl）的LB培養液中，37℃恒溫搖床（250r/min）培養過夜。用質粒小量抽提試劑盒小量提取質粒，將鑒定證實后的細菌培養擴增，取1管送上海桑尼生物公司測序驗證。

1.2.2 panc-1細胞的穩定轉染及熒光顯微鏡觀察將5×104細胞種植于6孔板，培養16h，待細胞融合率達70%時，將0.8μg RNAi干擾質粒和2μl Lipofectamine 2000分別加至50μl無血清DMEM（高糖）培養液中，輕輕搖勻，5min后將兩者混勻，室溫放置15min，再將其加入PBS漂洗后的panc-1細胞，邊加邊輕輕混合，轉染混合液總體積為2ml。將轉染后的細胞置37℃、5%CO2的孵箱中孵育6h后棄去轉染液，加入含10%胎牛血清的1640培養液中繼續培養至24h，收集部分細胞，用于總RNA抽提。另取部分細胞按1∶10稀釋，將其轉種于另一培養板，再經過24h后，向培養液中加入終濃度為500μg/ml的G418進行抗性篩選，1周后熒光顯微鏡下可見有細胞克隆發出熒光，對陽性克隆進行有限稀釋，擴大培養后獲得穩定表達的細胞株。

1.2.3 定量RT-PCR檢測所篩選克隆Livin mRNA的表達 取Trizol試劑提取的細胞總RNA 2μg，逆轉錄合成cDNA，以野生型panc-1細胞為對照。Livin基因引物F：5′-ATGGGACCTAAAGACAGTGCC-3′；引物F：5′-GCGGCCAGTCATAGAAGGAG-3′；β-actin引物F：5′-AAGATGACCCAGATCATGTTTGA-3′；引物R：5′-TTAATGTCACGCACGAT-TTCC-3′，由上海基康生物公司合成，取0.1μg cDNA作模板，分別擴增Livin和β-actin基因。20ul體系含cDNA 0.1μg、10μM/L上游和下游引物、2×Faststart universal SYBR Green Master（含Rox）10μl，滅菌雙蒸水補足至20μl。擴增程序為：預變性95℃2min；95℃15s、60℃1min，40個循環；最后作溶解曲線分析，95℃ 15s、60℃ 1min，95℃ 15s、60℃15s。用ABI7300進行PCR擴增和分析。

1.2.4 Western blot鑒定Livin shRNA沉默效果 取穩定轉染RNAi-Livin建系的panc-1細胞系對數生長期細胞，抽提總蛋白，以野生型panc-1細胞為對照。取各組細胞抽提蛋白10μg，加適量5×上樣緩沖液，經煮沸變性后，行10%SDS-PAGE電泳（80V，120min），切取含目的蛋白凝膠，轉膜15V，25min。用含3%BSA的PBST 4℃封閉過夜，Livin抗體（1∶2 000），GAPDH多抗（1∶1 000）4℃標記過夜，PBST洗滌5次后，標記二抗（1∶10 000），洗膜后，ECL顯色，曝光，顯影并定影，成像分析。

2 結果

2.1 重組Livin shRNA真核表達載體的測序結果 見圖1。

由圖1可見，所獲得的重組干擾質粒目的片段與預期相符，表明退火形成的干擾寡核苷酸成功連接入pGCsilencerTM U6/Neo/GFP/RNAi載體。

2.2 重組shRNA載體轉染panc-1細胞后熒光顯微鏡下觀察所見 見圖2。

由圖2可見，由于pGCsilencerTM U6/Neo/GFP/ RNAi載體帶有綠色熒光報告基因，因此，干擾載體pGCsilencerTM U6/Neo/GFP/RNAi-Livin shRNA轉染成功的panc-1細胞會發出綠色熒光，表明panc-1細胞中有轉染的外源基因表達。

2.3 定量RT-PCR檢測結果 見圖3。

由圖3可見，siRNA-Livin干擾序列對胰腺癌panc-1細胞Livin mRNA有抑制作用，尤其是打靶序列Livin-1的沉默效果與野生型panc-1細胞差異明顯，而打靶序列Livin-2和Livin-3對其mRNA轉錄水平無明顯抑制效應。

2.4 Western blot檢測蛋白表達水平結果 見圖4。

由圖4可見，野生型panc-1細胞Livin蛋白呈陽性表達，經導入外源性shRNA-Livin-1后，其蛋白表達水平明顯下降。

3 討論

胰腺癌是一種高度惡性的消化道腫瘤，其發病率近幾年來呈上升趨勢。在美國，胰腺癌占消化道腫瘤患者死亡原因的第2位；在我國，近20年來其發病率也增加了約40%。胰腺癌病情隱匿，早期癥狀不典型，發展迅速，具有高度侵襲性，預后差，大多數患者確診時已屬晚期，手術切除率較低，5年生存率低于4%。胰腺癌對現有的化療、放療及免疫治療效果也均不理想，迫切需要尋找新的治療手段。隨著分子生物學和基因組學的發展，胰腺癌的基因治療已經在多個方面取得了突破性進展，已成為治療腫瘤的希望所在。研究表明胰腺癌的發生涉及到多種癌基因、抑癌基因、生長因子、細胞黏附因子及DNA修復基因等的異常和積累，基因治療有可能成為胰腺癌治療的發展方向。

圖1 重組Livin shRNA真核表達載體測序圖（A、B、C分別為Livin-1、Livin-2和Livin-3的siRNA序列）

圖2 重組shRNA載體轉染panc-1細胞后熒光顯微鏡下觀察所見[A：重組shRNA載體轉染panc-1細胞后24h（×100）；B：重組shRNA載體轉染panc-1細胞后陽性克隆細胞培養（×100）]

圖4 Western blot檢測胰腺癌細胞panc-1轉染前后Livin蛋白表達差異（1：未轉染組；2：轉染組）

圖3 定量RT-PCR檢測結果

RNAi技術是近年發展的一項特異性抑制基因表達的新方法，是雙鏈RNA導入細胞或通過載體在細胞內轉錄成具有發夾結構的雙鏈RNA，能夠高效特異地剔除同源基因表達，形成相應的功能缺陷表型的一種技術，其機制是RNAi在真核細胞中的發生過程是通過一個被稱之為Dicer的酶，將dsRNA裂解成21-25核苷酸的siRNA。siRNA變成細胞內RNA誘導沉默復合體的一部分，該復合物通過互補靶定將要降解的細胞內的mRNA，最終將細胞中的基因表達阻斷，隨著對siRNA研究的不斷深入，越來越多的研究顯示siRNA在基因治療的潛在優勢。與其他幾種基因封閉技術相比，siRNA具有更強大、更持久的抑制基因表達的能力，其效能是反義寡核苷酸100～10 000倍[1]；siRNA具有序列特異性高、無免疫原性及體積小等優點，這就為治療癌癥這類由于多基因表達失調導致的疾病提供了可能[2]。利用RNAi技術沉默特定基因，可實現快速、高效、個體化的基因治療，在疾病的基因治療上有廣闊的應用前景[3]。采用RNAi技術在膀胱癌、乳腺癌、白血病、原發性肝癌等人類腫瘤細胞株體外﹑體內抑制實驗中均己獲得了成功[4-5]。

凋亡不足是惡性腫瘤對化學治療及放射治療產生耐受的重要因素，因為許多抗腫瘤治療是通過誘導腫瘤細胞凋亡實現的。如何抑制抗凋亡基因的表達，誘導腫瘤細胞發生凋亡，是目前腫瘤靶向治療的新方向。Livin是最近發現的IAP家族的新成員，在正常成人的大多數終末組織中（除胎盤）表達極低，甚至不表達，但在胎兒發育過程中，多種組織以及多數惡性腫瘤中高表達。大量研究資料表明，Livin在惡性腫瘤組織中異常高表達且不存在組織特異性，惡性黑色素瘤、鼻咽癌、肺癌、膀胱癌、宮頸癌、乳腺癌、淋巴瘤等癌組織均可高表達[6-8]。國外研究者使用具有靶向作用的siRNA干涉內源性Livin基因的表達，使Livin基因沉默而不表達蛋白，在使用阿霉素、紫外線照射以及TNF等凋亡促進劑治療后，凋亡率大大增加[9-10]。上述研究表明，通過抑制Livin能顯著提高腫瘤細胞對促凋亡刺激的敏感性，抑制其表達可望成為治療惡性腫瘤的新方法。

在本實驗中，我們針對Livin基因的編碼區設計了shRNA序列，采用RNA干擾技術，成功構建了能在真核細胞中表達Livin shRNA序列的載體，并導入胰腺癌細胞，建立了穩定轉染的panc-1細胞系，同時通過定量RT-PCR檢測顯示該RNAi-Livin干擾序列能有效沉默胰腺癌panc-1細胞Livin基因的表達，為以Livin基因為靶點的胰腺癌基因治療提供了重要的實驗依據。

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Construction of LivinshRNA vector and its effect on expression of Livin mRNA and protein in pancreatic cancer cells

ZHANG Caiming，JI Yiming，ZHU Min，et al.
Department of Hepatobiliary Surgery，Taizhou Hospital of Zhejiang Province,Taizhou 317000, China

【 Abstract】 Objective To construct LivinshRNA eukaryotic expression vectors and to investigate its effect on expression of Livin mRNA and protein in pancreatic cancer cell line panc-1. Methods Livin gene interference sequence was synthesized and inserted into pGCsilencerTM U6/Neo/GFP/RNAi vector，which was confirmed by sequencing.The recombinant RNAi vector was transfected into pancreatic cancer panc-1cells by Lipofectamine 2000.The cells containing stable transformants were selected by G418,and isolated with limited dilution.The mRNA expression of Livin in the selected clones was detected by RT-PCR,the protein expression of Livin was detected by Western blot. Results The successful construction of RNAi eukaryotic expression vectors targeting Livin was confirmed by sequencing,which was expressed in panc-1 cells after transfection as showed by green fluorescence under inverted fluorescence microscope.RT-PCR and Western blot revealed that the expression of Livin mRNA and protein was down-regulated in panc-1 cells. Conclusion Livin shRNA eukaryotie expression vector was successfully constructed and the transfected pancreatic cancer panc-1 cells show a down-regulated expression of Livin mRNA and protein．

Livin gene RNA interference Transfection panc-1 cell

2014-07-11）

（本文編輯：楊麗）

臺州市科技局計劃項目（102KY09）

317000 臺州恩澤醫療中心（集團）浙江省臺州醫院肝膽外科

季一鳴，E-mail：jiymjiym@163.com