miR-29a在系統性紅斑狼瘡患者血漿中的表達及意義

徐玲娟 葉璐璐 陳阿瓊 黃茜茜 章慧娣 陳朝生 薛向陽

miR-29a在系統性紅斑狼瘡患者血漿中的表達及意義

徐玲娟 葉璐璐 陳阿瓊 黃茜茜 章慧娣 陳朝生 薛向陽

目的鉬分析microRNA-29a（miR-29a）在系統性紅斑狼瘡（SLE）患者血漿中的表達水平及與SLE臨床特征的相關性。 方法 建立檢測miR-29a的實時熒光定量PCR（RT-qPCR）方法，分析48例SLE患者和20例健康體檢者血漿中miR-29a的表達水平，ROC曲線評估其作為SLE診斷標記物的意義，統計分析其表達與SLE患者臨床特征的相關性。 結果 與健康體檢者比較，SLE患者血漿miR-29a表達水平明顯上調（Z=3.476，P=0.0009）；血清miR-29a診斷SLE的ROC AUC為0.794（95%CI: 0.689～0.898），具較好診斷SLE的效能；抗β2GP1抗體＞20RU/ml患者的血漿miR-29a水平明顯升高（P=0.033），Pearson相關分析顯示，SLE患者血漿miR-29a表達水平與抗β2GP1抗體水平呈正相關（r=0.584，P=0.001），而與不同SLEDAI評分及其他SLE活動相關指標等差異均無統計學意義（均P＞0.05）。 結論 miR-29a在SLE患者血漿中的表達水平明顯上調，且血漿miR-29a上調與SLE患者自身抗體水平相關，其調節(jié)機制尚待進一步的研究。

系統性紅斑狼瘡 臨床診斷 微小RNA miR-29a

系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種常見、累及多系統的自身免疫性疾病。microRNA（miRNA）是一類長度約為19～23個核苷酸的非編碼RNA，通過互補配對在轉錄后水平調控其特定靶基因的表達[1]。近年來的研究發(fā)現，血漿（血清）、唾液、尿液、乳汁等細胞外體液中也存在miRNAs[2-4]。其中一些血漿（血清）miRNA被證明可用于腫瘤、心血管疾病、糖尿病等多種疾病的生物標志物[5-8]。筆者前期采用miRNA芯片分析SLE患者miRNA表達發(fā)現，與正常對照者比較，SLE患者血漿中miR-29家族成員的miR-29a表達明顯升高。有研究顯示，miR-29家族可調節(jié)T、B細胞的發(fā)育及功能，是一種強有力的免疫調節(jié)劑[9-11]。本研究進一步通過定量PCR檢測SLE患者血漿miR-29a的表達水平，探討其與SLE臨床特征的關系，現將結果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2011年3月至2013年9月由浙江中醫(yī)藥大學附屬金華市中醫(yī)醫(yī)院腎病風濕免疫科收治的SLE患者48例，其中男5例，女43例，年齡20～65歲，中位年齡35歲。所有患者均符合美國風濕病學會1997年修訂的SLE診斷標準，采用SLE病情活動評分（SLEDAI評分）評估疾病活動度。選取同期浙江中醫(yī)藥大學附屬金華市中醫(yī)醫(yī)院健康體檢者20例作為健康對照組，其中男3例，女17例，年齡18～56歲，中位年齡32歲。排除心血管、腫瘤以及其他自身免疫性疾病。兩組性別、年齡比較均無統計學差異（均P＞0.05）。

1.2 主要試劑 Tri-Reagent BD試劑購自美國Sigma公司，ReverTra Ace qPCR RT Kit逆轉錄試劑盒及SYBR Master Mix定量PCR試劑購自日本Toyobo公司，焦碳酸二乙酯（DEPC）處理水購自寶生物工程（大連）有限公司，其他試劑均為分析純，引物由上海英俊生物技術有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 標本收集及保存 取EDTA抗凝的外周血，4℃，3 000r/min離心10min，收集血漿，進一步去除殘留的細胞碎片，4℃，12 000r/min離心10min。血漿標本置-80℃冰箱保存。

1.3.2 血漿 RNA抽提 按Tri-Reagent BD試劑說明書步驟抽提血漿RNA。為增加RNA得率，在抽提時加入1μl糖元損失，并采用80%乙醇洗滌RNA沉淀。以DEPC處理水溶解RNA，-80℃保存。為消除血漿RNA抽提的誤差，每份標本均取200μl，而且抽提前加入1μl與人miRNAs無同源性的cel-miR-39外參照。

1.3.3 miR-29a表達的檢測 按照ReverTra Ace qPCR RT Kit逆轉錄試劑盒說明書，以5μl血漿RNA以miR-29a莖環(huán)RT引物進行逆轉錄。莖環(huán)RT引物序列為：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGTATTCGCACTGGATACGACTAACCGAT-3′。逆轉錄反應條件為16℃退火30min，42℃延伸30min，98℃5min終止反應。逆轉錄產物-20℃保存。以20μl反應體系進行定量PCR檢測miR-29a表達，PCR反應體系含：逆轉錄產物1μl，0.5μmol/ L miR-29a特異性正向引物，0.5μmol/L miR-29a特異性反向引物，SYBR Master Mix-Plus 10μl，Plus solution 2μl。PCR反應條件為：95℃預變性5min后，95℃變性15s，60℃退火、延伸1min，循環(huán)40次。miR-29a特異正向引物序列為5′-ATGGTTCGTGGGTAGCACCATCTGAAAT-3′，特異反向引物為5′-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3′。外參照cel-miR-39的檢測按照QIAGEN公司熒光定量PCR檢測試劑盒進行，每個樣品有3個復孔。采用ABI 7500實時定量PCR儀進行檢測，記錄每個孔中熒光信號到達設定閾值時的循環(huán)數（Ct值）。根據待測標本的Ct值，以cel-miR-39作為外參照，采用定量PCR中的相對定量法，以N=2-△Ct表示標本中miR-29a相對表達量，其中△Ct=CtmiR-29a-Ctcel-miR-39。為方便數據計算，所有數值均放大10 000倍。PCR產物采用4%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 統計學處理 采用SPSS 18.0統計軟件。計量資料以中位數及四分位間距表示，兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗，多組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗。采用ROC曲線分析miR-29a檢測結果診斷SLE的靈敏度和特異度，miR-29a表達水平與抗β2GP1抗體水平的相關性采用Pearson相關。

2 結果

2.1 血漿miR-29a檢測的特異性分析 miR-29a定量PCR特異度分析見圖1。miR-29a定量PCR的溶解曲線為單峰，其PCR產物經4%瓊脂糖凝膠電泳顯示為單一條帶，而未逆轉錄的RNA對照及空白對照均無擴增產物，說明建立的定量PCR體系可以特異檢測血漿標本中miR-29a。

圖1 miR-29a定量PCR特異度分析（A：4%瓊脂糖凝膠電泳miR-29a PCR產物的結果；B：miR-29a定量PCR的溶解曲線）

2.2 SLE患者血漿miR-29a水平的表達 SLE患者及健康對照組血漿中miR-29a表達水平為分別10.40（6.09，17.86）和4.07（3.60，6.02），兩組比較差異有統計學意義（Z=3.476，P=0.0009），詳見圖2。血清miR-29a診斷SLE的ROC AUC為0.794（95%CI:0.689～0.898），以1.0255作為診斷閾值，其靈敏度為0.755，特異度為0.75，詳見圖3。

圖2 SLE患者和健康對照組血漿miR-29a表達水平的比較

圖3 SLE患者血漿miR-29a診斷的ROC曲線

圖4 SLE患者血漿miR-29a表達與抗β2GP1抗體水平關系散點圖

2.3 SLE患者血漿miR-29a表達水平與SLE常見臨床特征的相關性 不同外周血中血小板、抗β2GP1抗體水平SLE患者血漿miR-29a表達水平的差異有統計學意義（均P＜0.05），而不同年齡、性別、ALT、AST等肝損害相關指標，血尿、蛋白尿等腎功能相關指標及CRP、C3、SLEDAI評分等SLE活動程度臨床指標SLE患者血漿miR-29a表達水平的差異均無統計學意義（均P＞0.05），詳見表1。Pearson相關分析顯示，SLE患者血漿miR-29a表達水平與循環(huán)中抗β2GP1抗體水平呈正相關（r=0.584，P=0.001），詳見圖4。

3 討論

作為細胞內基因表達調節(jié)網絡的重要調節(jié)者，miRNA已被證實參與了免疫細胞的分化、功能及各種自身免疫性疾病發(fā)生、發(fā)展過程[12]。細胞外游離的miRNA作為疾病標志物是近年來研究的熱點。許多血漿miRNA已被證實是癌癥、心血管疾病等多種疾病的生物標志[6-7,13]。但關于血漿（血清）miRNA與SLE相關性僅少數報道，發(fā)現了血清中miR-200家族、miR-205、miR-192、miR-146a、miR-142-3p、miR-126、miR-125a-3p、miR-155、miRNA-142-3p、miR-181a、miR-106a、miR-17、miR-20a、miR-203、miR-92a、miR-342-3p、miR-223及miR-20a等表達及作為SLE生物標記的可能[14-17]。由于標本來源及檢測手段不同，不同研究者得到的結果也不盡相同。

miR-29a屬于miR-29家族中的一員，人類miR-29家族還包括miR-29b和miR-29c。許多研究已經證實[18-21]，下調表達的miR-29a在多種腫瘤的增殖、轉移過程中發(fā)揮重要調節(jié)作用。在急性髓細胞白血病的研究中發(fā)現，miR-29a表達水平越低，其復發(fā)緩解時間越短，預后越差[22]。已經證實，內皮細胞中的miR-29a可通過作用于磷酸酶及張力蛋白同源物（PTEN），刺激血管生長[23]；此外，miR-29a通過調節(jié)靶基因Ⅰ型膠原mRNA，同時能降低成纖維細胞增殖，導致過多的膠原生成[24]。另外，已經證明，miR-29可調控IFN-γ[11]、B7-H3共刺激分子[25]、緩激肽受體2（BDKR2）、CCL8、緊密連接蛋白1（CLDN-1），吲哚胺雙加氧酶（IDO）、IL-2受體α鏈（IL-2RA）、IL-12p40等[26]重要免疫調節(jié)分子的表達。近期Qin等[27]在SLE的CD4+T細胞中發(fā)現與miR-29a同家族的miR-29b表達水平上調，并通過抑制DNMT1的表達，從而使CD4+T細胞中DNA低甲基化。有研究證實，在狼瘡活動患者的T細胞中呈現出DNA甲基化全面減少，而且T細胞中的甲基化水平與狼瘡疾病活動有關[28-30]。本研究通過定量PCR分析發(fā)現，SLE患者血漿中的miR-29a表達水平明顯上調，但未發(fā)現miR-29a與SLE疾病活動度有相關性。

表1 SLE患者血漿miR-29a表達水平與SLE常見臨床特征的相關性

在對臨床相關性資料作進一步分析后發(fā)現，抗組蛋白抗體及抗β2GP1抗體＞20RU/ml患者血漿miR-29a水平明顯升高，且miR-29a的表達水平與循環(huán)中抗β2GP1抗體水平呈正相關。已經明確，B細胞過度活化增殖產生多種自身抗體（尤其是抗核抗體）不但是SLE活動的重要指標，而且是SLE發(fā)病機制的中心環(huán)節(jié)。這些結果提示血漿miR-29a可能和SLE患者自身反應性B細胞的功能有關。本研究結果還發(fā)現，血漿中miR-29a的表達水平與SLE患者血小板數量有關，提示檢測miR-29a對臨床判斷SLE繼發(fā)血小板減少有一定價值。

綜上所述，SLE患者血漿miR-29a表達水平上調可能與自身抗體產生及血液系統損害相關，為SLE患者病情臨床評價及干預治療提供了一條新的線索，其調節(jié)機制尚待進一步的研究。

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Expression of miR-29a in plasma of patients with systemic lupus erythematosus and its clinical significance

XU Linjuan,YE Lulu，CHEN Aqiong,et al.Department of Clinical Laboratory,Affiliated Jinhua TCM Hospital,Zhejiang Chinese Medical University, Jinhua 321017,China

Objective To investigate the expression of microRNA-29a(miR-29a)in plasma of patients with systemic lupus erythematosus(SLE)and its clinical significance. Methods The expression of plasma miR-29a was detected with real-time quantitative polymerase chain reaction(qRT-PCR）in 48 SLE patients and 20 healthy subjects.The value of miR-29a for diagnosis of SLE was assessed by the receiver operating characteristic (ROC)curve.The relationship between the plasma miR-29a levels and clinical characteristics was analyzed. Results Compared with the healthy controls,the expression of miR-29a in plasma of patients with SLE was significantly higher(Z=3.476,P=0.0009).The area under the curve(AUC)of ROC was 0.794(95%CI: 0.689-0.898).Patients with positive anti-β2GP1 antibody showed higher miR-29a levels in plasma than those with negative anti-β2GP1 antibody(P=0.033).In addition,Pearson analysis indicated that the plasma level of miR-29a was positively correlated with the level of anti-β2GP1 antibodies(r=0.584,P=0.001).However,the SLEDAI score and other clinical indicators of SLE activation were not significantly correlated with the plasma level of miR-29a. Conclusion The expression of miR-29a in the plasma of SLE patients is up-regulated,which were associated with the levels of several auto-antibodies.

Systemic lupus erythematosus Clinical diagnosis MicroRNA MiR-29a

2015-02-06）

（本文編輯：嚴瑋雯）

浙江省科技廳科研基金資助項目（2012C33126）；浙江省大學生新苗計劃（2015R413027）；金華市科技局科研基金資助項目（2013-3-014）

321017 浙江中醫(yī)藥大學附屬金華市中醫(yī)醫(yī)院檢驗科（徐玲娟）；溫州醫(yī)科大學微生物學和免疫學教研室，分子病毒與疫苗研究所，熱帶醫(yī)學研究所（葉璐璐、黃茜茜、薛向陽）；寧波李惠利醫(yī)院風濕免疫科（陳阿瓊）；溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腎內科（章慧娣、陳朝生）

薛向陽，E-mail：wyxyy001@163.com