孕早、晚期接受七氟醚麻醉對大鼠子代大腦神經發育的影響

陳弦 陶凡 黃麗霞 范皓

孕早、晚期接受七氟醚麻醉對大鼠子代大腦神經發育的影響

陳弦 陶凡 黃麗霞 范皓

目的鉬研究孕早、晚期Wistar大鼠母體接受七氟醚吸入麻醉對子代大腦神經發育的影響。方法鉬將12只孕鼠按隨機數字表法分為孕6d用藥組（A組）、孕19d用藥組（B組）和對照組（C組），每組各4只。A、B組分別于孕6d、孕19d時吸入2.4%七氟醚6h，C組飼養于空氣條件下。應用Nissl染色法觀察仔鼠在出生后第1、14、21天腦組織海馬CA1區神經元尼氏體的表達情況。在仔鼠出生后第32天采用Morris水迷宮實驗對各組仔鼠學習記憶功能進行測定。 結果 出生后第1天，B組仔鼠海馬CA1區神經元損傷程度明顯高于A組及C組仔鼠；出生后第14天，B組仔鼠神經損傷減輕，A組仔鼠神經損傷加重；出生后第21天，B組仔鼠神經損傷程度較輕，A組仔鼠神經損傷較重。出生后第32天，A組和B組仔鼠逃避潛伏期、穿越目標象限次數、穿越平臺次數與對照組仔鼠相比均無統計學差異（均P＞0.05）。 結論 在本實驗條件下，孕早、晚期母體接受2.4%七氟醚麻醉對Wistar大鼠子代大腦神經發育的影響隨時間變化而改變，并不造成子代遠期學習記憶功能異常。

七氟醚 子代 學習記憶 尼氏體 孕早期 孕晚期 大鼠

七氟醚是臨床常用的吸入麻醉劑，其理化性質穩定，誘導迅速，刺激性小，對循環抑制輕。隨著產科微創手術的廣泛開展，越來越多的孕產婦需要使用麻醉藥，甚至在某些緊急情況下需要接受全身麻醉。目前，七氟醚對孕期胎兒是否安全尚無定論。本實驗旨在評價孕早期、孕晚期母體接受七氟醚麻醉后對子代大腦神經發育及遠期認知功能的影響，為臨床麻醉提供依據。

1 材料和方法

1.1 動物模型制備與分組 成年性成熟未交配雌性Wistar大鼠（由浙江中醫藥大學動物中心提供）24只，體重180～210g。成年性成熟雄性Wistar大鼠（由浙江中醫藥大學動物中心提供）24只，體重300g。雌鼠與雄鼠1∶1合籠飼養。應用托盤陰栓檢查法于次日早晨觀察托盤中是否有陰栓，發現陰栓當天記為受孕第0日。排除不孕及假孕雌鼠，將12只懷孕雌鼠采用隨機數字表法分為3組，孕6d用藥組（A組）、孕19d用藥組（B組）以及對照組（C組），每組各4只。A、B組分別在孕鼠懷孕第6、19天給予七氟醚吸入，濃度2.4%，時間6h，氧流量0.5L/min。C組一直飼養于空氣條件下。

1.2 自制麻醉箱 將A、B組孕鼠分別于孕6d及孕19d放入20cm×12cm×10cm自制小盒內，在盒的兩側各有一小孔，一端接小動物麻醉機（浙江中醫藥大學動物中心提供），輸入100%氧氣和七氟醚氣體。另一端為出氣端，接廢氣吸收罐以吸收CO2等。氧流量0.5L/min，七氟醚吸入濃度2.4%，持續時間6h。后將孕鼠置于空氣條件下自然蘇醒。

1.3 組織切片制備 孕鼠自然分娩，A組、B組和C組仔鼠中分別取出生后第1、14、21天仔鼠各6只，斷頭取腦，固定于10%中性甲醛溶液中72h。切取包含海馬部位的腦組織塊，進行梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，行冠狀位連續切片，片厚約4μm。

1.4 Nissl染色 組織切片脫蠟至水，加1%甲苯胺藍水溶液后浸染25min，95%乙醇快速分色，無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。光鏡下觀察海馬CA1區神經元的形態學變化。

1.5 Morris水迷宮實驗 分別從A、B、C組仔鼠中再選取7只、8只、7只，待長大至第32天行Morris水迷宮實驗。Morris水迷宮由一個直徑120cm、高50cm的圓形水池構成，水池內壁為黑色，水池劃分為4個象限，每個象限設置入水點標記，于第4象限內放置直徑12cm，高29cm的透明平臺，槽內水深30cm，使平臺沒于水下1cm，水溫控制在23～25℃，水池上方安裝自動攝像系統。參照文獻[1]，Morris水迷宮實驗包括定位航行實驗5d以及空間探索實驗1d。將平臺所在象限定為目標象限。在5d的定位航行實驗中，各組仔鼠每日在規定時間內訓練3次，每次間隔1h。將仔鼠分別從除目標象限以外的其余3個象限入水點面向池壁放入水中，第1次入水選擇離目標象限最遠的象限，第2、3次入水選擇目標象限毗鄰象限入水。記錄120s內尋找到平臺的時間（逃避潛伏期），并讓仔鼠在平臺上停留10s，超過120s未能找到平臺者，將其輕柔引導上平臺并停留在臺上10s，將其尋找平臺的時間定為120s，取每天第1次訓練的結果為當天的逃避潛伏期；在第6天的空間探索實驗中，撤去平臺，將仔鼠從最遠象限面向池壁放入水中，計數仔鼠在1min內穿越平臺原址的次數及穿越目標象限的次數。

1.6 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件，計量資料以示，組間比較用單因素方差分析，若方差齊，兩兩比較采用LSD檢驗，若方差不齊，兩兩比較采用Dunnett’s T3檢驗。

2 結果

2.1 3組仔鼠腦組織海馬CA1區神經元的形態學變化出生后第1天，與C組仔鼠相比，B組仔鼠海馬CA1區神經元排列稀疏，細胞間隙增大，有神經元缺失，細胞質內尼氏體數目減少或消失，A組仔鼠海馬CA1區神經元排列稍顯松散，細胞略腫脹，細胞質著色稍淺，尼氏體數目略有減少，詳見圖1。出生后第14天，與C組仔鼠相比，B組仔鼠海馬CA1區神經元排列整齊，細胞數目較多，細胞質著色深，尼氏體數目大致正常；A組仔鼠海馬CA1區神經元排列紊亂，細胞腫脹，染色較淺，細胞質內尼氏體數目減少，詳見圖2。出生后第21天，與C組仔鼠相比，B組仔鼠海馬CA1區神經元排列尚整齊，細胞層數偏少，細胞未見明顯腫脹，細胞質著色稍淺，尼氏體數目大致正常；A組仔鼠海馬CA1區神經元排列較稀疏，細胞腫脹，細胞質著色淺，尼氏體數目減少，詳見圖3。

2.2 3組仔鼠逃避潛伏期比較 在定位航行試驗中，3組仔鼠在逃避潛伏期比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），詳見表1。

表1 3組仔鼠逃避潛伏期比較（s）

2.3 3組仔鼠穿越目標象限和平臺次數比較 在空間探索試驗中，3組仔鼠穿越目標象限及平臺次數的比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），詳見表2。

表2 3組仔鼠穿越目標象限和平臺次數比較

3 討論

七氟醚是臨床常用的吸入麻醉劑。研究表明所有吸入麻醉藥均可通過胎盤作用于胎兒，若濃度大，血藥濃度高，則會對胎兒產生抑制作用[2]。本研究選擇濃度為2.4%（=1MAC）[3]七氟醚吸入6h作用于孕鼠，觀察此麻醉濃度是否會對仔鼠造成認知功能的影響。

光鏡下尼氏體為嗜堿性斑塊或細顆粒，均勻分布于神經元細胞質中。若尼氏體大而數量多，說明神經元合成蛋白質的功能較強，相反，在神經元受到損傷時，尼氏體從核周開始崩解為細塵狀顆粒，進而溶解消失，光鏡下表現為尼氏體數量會減少甚至消失。在本實驗中，在出生后第1天，B組仔鼠海馬CA1區神經元損傷程度明顯高于A組及C組仔鼠；出生后第14天，B組仔鼠海馬CA1區神經元損傷程度較前減輕，A組仔鼠海馬CA1區神經元呈現損傷逐漸加重趨勢；出生后第21天，與C組仔鼠相比，A組仔鼠海馬CA1區神經元仍然呈現嚴重損傷表現，B組仔鼠損傷程度較輕。該結果提示，孕晚期吸入七氟醚所導致的子代神經損傷可能具有“可逆性”，孕早期吸入七氟醚對子代神經發育可能具有“延遲損傷效應”。

圖1 出生后第1天各組仔鼠海馬CA1區神經元形態（A:A組仔鼠；B:B組仔鼠；C：C組仔鼠；Nissl染色，×400）

圖2 出生后第14天各組仔鼠海馬CA1區神經元形態（A:A組仔鼠；B:B組仔鼠；C：C組仔鼠；Nissl染色，×400）

圖3 出生后第21天各組仔鼠海馬CA1區神經元形態（A:A組仔鼠；B:B組仔鼠；C：C組仔鼠；Nissl染色，×400）

Morris水迷宮實驗是評價與海馬功能相關的空間參考記憶的主要行為學實驗方法之一。Wistar大鼠32天齡相當于人類8歲，為學齡期的起始段，本實驗選擇在這個時間段進行認知功能測定。定位航行實驗的逃避潛伏期可以反映實驗動物獲取空間信息的能力。隨著每天訓練次數的增加，實驗動物的瞬時記憶得到強化，為更準確地反映其學習記憶能力，排除瞬時記憶對結果的干擾，本實驗選擇每天的第1次數據結果作為對其前1天學習內容的記憶能力考評依據[1]。空間探索實驗反映了實驗動物對反復訓練所獲取信息的儲存和再現能力。本實驗中，在第1天的定位航行實驗中，3組仔鼠首次入水后的逃避潛伏期無明顯差異；在第2、3、4、5天的定位航行實驗中，與C組仔鼠相比，A、B組仔鼠的逃避潛伏期均無統計學差異，說明3組仔鼠對前1天學習內容的記憶能力無明顯差異。在空間探索實驗中，3組仔鼠穿越平臺次數及穿越目標象限次數無統計學差異，說明孕早、晚期孕鼠吸入2.4%七氟醚6h并不會導致子代在學習記憶能力等行為學表現上出現明顯差異。

目前關于七氟醚對神經系統的影響褒貶不一。有研究認為七氟醚對缺血缺氧性腦損傷具有神經保護作用[4-5]，另有研究認為七氟醚不會對大腦神經元發育造成影響[6]，亦有研究認為七氟醚會對發育期大腦神經元產生毒性影響[7-11]，其中部分學者認為這種有害影響僅短期存在，不會持續至遠期[9-11]，但亦有學者認為這會導致遠期認知功能障礙[7]。本實驗發現3組仔鼠在出生后32d行水迷宮實驗中并未出現學習記憶能力方面的差異，這與李夢圓等[12]的研究結果相符。結合各組仔鼠在出生后不同階段海馬CA1區尼氏體染色結果，考慮可能是神經損傷已經修復，也可能是神經損傷程度較輕并不至于引起行為學上異常表現。

綜上所述，孕早期及孕晚期Wistar大鼠母體接受2.4%七氟醚麻醉對子代大腦神經發育的影響隨時間變化呈動態改變，并不造成子代遠期的學習記憶功能異常。其原因也許是七氟醚對大腦發育影響僅為一過性，或是該影響不足以產生行為學上的學習記憶能力異常，具體機制仍需進一步研究以證實。

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Effect of sevoflurane inhalation anesthesia during early and late pregnancy on offspring brain neural development in rats

CHEN Xian，TAO Fan，HUANG Lixia，et al.Department of Anesthesiology,Hangzhou Red Cross Hospital，Hangzhou 310003,China

【 Abstract】 Objective To investigate the effect of sevoflurane inhalation anesthesia during early and late pregnancy on offspring brain neural development in rats. Methods Twelve pregnant Wistar rats were randomly divided into group A(6-day gestation),group B(19-day gestation)and group C(control group)with 4 animals in each group.The rats in groups A and B received 2.4%sevoflurane(0.5L/min)oxygen for 6 h at 6th and 19th day of pregnancy,respectively,while those in control group had no any treatment.The expression of Nissl body in the CA1 region of hippocampus of the offspring at postnatal d1,d14 and d21 were observed with Nissl staining technique.The learning and memory function of the offspring was tested by Morris water maze test at postnatal d32. Results At postnatal d1,the injury in the CA1 region of hippocampus of the offspring in group B was more serious than that in group A and C.At postnatal d14,the neural injury of the offspring in group B was alleviated,but that in group A was worse.At postnatal d 21,the neural injury of the offspring in group B was mild,but that in group A was serious. There were no significant differences in escape latency,explore number in the target quadrant and platform of among the offspring of groups A,B and C(P＞0.05). Conclusion The effect of sevoflurane inhalation during early and late pregnancy on offspring brain neural development is time-dependent,but has no significant effect on the learning and memory function.

Sevoflurane Offspring Learning and memory Nissl body Early pregnancy Late pregnancy Rats

2015-01-28）

（本文編輯：嚴瑋雯）

杭州市衛生科技計劃項目（2012A044）

310003 杭州市紅十字會醫院麻醉科

陶凡，E-mail：461226058@qq.com