HBsAg對脂多糖誘導樹突狀細胞分泌IL-6和IL-12的影響

湯永志 燕飛 朱堅勝 陳華忠 朱敏 肖明 林希 邵輝

●基礎研究

HBsAg對脂多糖誘導樹突狀細胞分泌IL-6和IL-12的影響

湯永志 燕飛 朱堅勝 陳華忠 朱敏 肖明 林希 邵輝

目的 研究HBsAg對脂多糖誘導樹突狀細胞（DCs）分泌IL-6和IL-12的影響。方法 采用重組人粒-單核集落刺激因子（rhGM-CSF）聯合重組人白細胞介素4（rhIL-4）誘導單個核細胞得到未成熟樹突狀細胞（iDCs），分別加入HB-sAg1、2、5μg/ml，并設對照組，各組再加入脂多糖誘導為成熟DCs。采用流式細胞術鑒定各組iDCs的表型（CD11c、HLA-DR），ELISA法檢測脂多糖誘導后培養上清液中IL-6和IL-12的水平。 結果 iDCs的CD11c/HLA-DR雙陽性率為（83.62± 6.89）%，顯著高于單純培養組（20.57±11.19）%，差異有統計學意義（P＜0.05）。HBsAg 1、2、5μg/ml組培養上清液中IL-6分別為（609.36±127.06）、（566.01±173.46）、（295.03±76.08）pg/ml，低于對照組（1356.97±181.78）pg/ml（均P＜0.05）；HBsAg 2、5μg/ml組IL-12分別為（854.49±67.92）、（472.09±55.70）pg/ml，低于對照組（1248.78±112.09）pg/ml（均P＜0.05）；1μg/ml組IL-12（1103.53±134.15）pg/ml，與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。結論 低濃度HBsAg可下調脂多糖誘導的DCs細胞因子分泌。

乙型肝炎表面抗原 樹突狀細胞 IL-6 IL-12

乙肝病毒感染慢性化機制復雜，目前認為乙肝病毒持續感染的主要機制是免疫耐受。樹突狀細胞（DCs）是最具潛力的專職抗原提呈細胞，在機體免疫應答中發揮重要作用，其功能主要取決于成熟狀態，未成熟DCs（iDCs）傾向于誘導免疫耐受，成熟DCs則誘導免疫激活引發免疫排斥反應，IL-6和IL-12是免疫應答過程中T細胞活化、抗原提呈的重要細胞因子。筆者通過外周血來源單個核細胞經刺激因子誘導形成的DCs被不同濃度HBsAg干預的方式，研究HBsAg干預后DCs分泌IL-6和IL-12的水平，現將實驗結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 RPMI-1640培養基購自美國Hyclone公司，胎牛血清購自美國Gibco公司，人淋巴細胞分離液購自上海華精生物高科技有限公司，脂多糖購自美國Sigma-aldrich公司，rhGM-CSF、rhIL-4購自美國R&D公司，HBsAg購自以色列Prospec公司，抗人HLA-DR FITC、抗人CD11c-PE及同型對照購自美國Ebioscience公司，IL-12/IL-6 ELISA試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司，新鮮外周血濃縮白細胞由浙江省臺州市中心血站提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 DCs體外誘導與分組 新鮮外周血濃縮白細胞與PBS按比例稀釋混勻，加至淋巴細胞分離液上層，2 500r/min離心30min，收集中間白膜層洗滌數次，加入無血清RPMI-1640重懸，置于37℃、5%CO2培養箱中，2h后收集貼壁細胞，一組加入含20%胎牛血清的RPMI-1640培養基（單純培養組），另一組加入含20%胎牛血清的RPMI-1640培養基與rhGM-CSF（50ng/ml）、rhIL-4（30ng/ml）（GM-CSF+IL-4誘導組），置于培養箱中培養，隔天半量換液。第7天時將rhGM-CSF+rhIL-4誘導組的iDCs分設3組：HBsAg 1、2、5μg/ml組，并設單純培養作對照組，第8天時加入脂多糖（1μg/ml）誘導24h獲得成熟DCs。

1.2.2 細胞形態的觀察與表型鑒定 收集培養7d后的懸浮細胞，分別在光學顯微鏡、電鏡下觀察細胞形態，采用流式細胞術鑒定iDCs表型：CD11c、HLA-DR。

1.2.3 細胞上清液IL-6/IL-12水平檢測 第9天時收集各組細胞培養的上清液。按IL-6/IL-12 ELISA試劑盒操作，測定各樣本A450值，繪制標準曲線，計算細胞因子水平。

1.3 統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件，細胞表型組間比較采用Mann-Whitney U檢驗，Levene檢驗方差齊性，細胞因子水平以表述，組間比較采用One way ANOVA的LSD-t檢驗。

2 結果

2.1 誘導培養后的細胞形態特點 誘導培養7d后光鏡下見細胞懸浮聚集，體積增大，形態不規則，表面可見較多樹杈樣突起。電鏡下細胞表面粗糙，有較多突起，為典型DCs形態。

2.2 DCs誘導效果的比較 rhGM-CSF+rhIL-4誘導7d，懸浮細胞CD11c/HLA-DR雙陽性率為（83.62±6.89）%，顯著高于單純培養組（20.57±11.19）%，差異有統計學意義（P＜0.05），與文獻報道的單核細胞來源iDCs一致[1]，見圖1。

2.3 不同HBsAg濃度組細胞因子水平的比較 見表1。

由表1可見，HBsAg 1μg/ml時，IL-12的水平與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05），2、5μg/ml組均顯著低于對照組（均P＜0.05）；IL-6水平隨HBsAg濃度依次降低（均P＜0.05），1μg/ml組與2μg/ml組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖1 單純培養組與rhGM-CSF+rhIL-4誘導組細胞雙陽性率的比較。與單純培養組比較，*P＜0.05

表1 不同HBsAg濃度組細胞因子水平的比較（pg/ml）

3 討論

DCs是體內功能最強的抗原提呈細胞，在乙型肝炎病毒清除過程中發揮重要免疫作用。脂多糖是G－菌的細胞壁成分，被廣泛應用于TLR4-MyD88信號通路的激活，導致下游基因轉錄合成多種細胞因子（如IL-12，IL-6，TNF等），啟動Th1反應[2-3]。已有研究表明HBV抗原（主要為HBsAg）可影響漿樣DCs功能表型，干擾其成熟過程以及TLR-9信號通路下游的細胞因子（IFN-α等）分泌[4-5]。HBsAg影響外周血單個核細胞TLR2/4 mRNA表達轉錄，新近研究發現HBsAg（25、50μg/ml）時通過NF-κB和p38通路明顯上調單核來源DCs的IL-12分泌，對Th細胞免疫進行正向調節[6-7]；更有日本學者報道慢性乙肝患者注射經HBsAg負載的DCs后可出現抗HBs抗體[8]。由此，HBsAg通過DCs相關信號通路進行免疫調節，可望遠期用于治療臨床慢性乙型肝炎。

本研究在脂多糖誘導單核來源DCs細胞因子分泌的過程中加入低濃度HBsAg，比較不同濃度HBsAg干預組與對照組IL-12/IL-6的分泌水平，結果發現HB－sAg在1μg/ml時IL-6分泌下降，而2μg/ml組和5μg/ml組IL-6水平下降更明顯；HBsAg對IL-12的分泌也有下調作用，其中2μg/ml組、5μg/ml組較為明顯。因此，HBsAg可通過TLR4-MyD88下游的信號通路干預DCs的細胞因子分泌。低濃度時HBsAg下調IL-6、IL-12等因子分泌，影響脂多糖誘導的DCs成熟，而HBsAg在25μg/ml以上濃度[6-7]時，相關信號通路激活，IL-12分泌上調，進而激活Th細胞免疫應答，發揮其免疫原性作用。

HBsAg較低濃度時影響DCs細胞因子分泌的確切分子機制尚需進一步研究證實。結合文獻，較高濃度HBsAg通過調節Th細胞的免疫應答，活化DCs，激活抗原提呈過程，完成細胞對乙肝病毒的免疫應答。

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Effect of HBsAg on IL-6/IL-12 production of mononuclear-derived dendritic cells stimulated by lipopolysaccharide

TANG Yongzhi, YAN Fei,ZHU Jiansheng,et al.
Department of Infectious Diseases,Taizhou Hospital Affiliated to Wenzhou Medical University,Taizhou 317000,China

Objective To investigate the effect of HBsAg on IL-6/IL-12 production of dendritic cells(DCs)stimulated by Lipopolysaccharide(LPS). Methods Mononuclear cells were isolated and cultured in complete medium containing GM-CSF plus IL-4 to obtain immature DCs.Flow cytometry were performed to define the phenotypic characteristics of iDCs.Different concentrations(1,2 and 5μg/ml)of HBsAg were added in culture medium.The DCs were cultured for 24 h for maturation,followed by a 24h-differentiation culture with LPS (1μg/ml).The inflammatory cytokines from cell supernatant were determined by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).Results The expression of CD11c and HLA-DR on immature DCs was(83.62± 6.89)%,compare to(20.57±11.19)%in control group.IL-6 production was significantly decreased with the treatment of HBsAg (1,2 and 5μg/ml,P＜0.05).IL-12 production demonstrates the similar results with the treatment of 2 and 5μg/ml HBsAg(P＜0.05),but no changes with the treatment of 1μg/ml HBsAg(P＞0.05). Conclusion HBsAg may down-regulate the secretion of cytokines in DCs stimulated by LPS at lower dosage.

HBsAg Dendritic cells Interleukin-6 Interleukin-12

2013-08-14）

（本文編輯：楊麗）

浙江省醫藥衛生科學研究基金計劃項目（2010KYB125）

317000 臺州，溫州醫科大學附屬臺州醫院感染科（湯永志、燕飛、朱堅勝、陳華忠、林希、邵輝），公共科研平臺（朱敏）；重慶醫科大學病理教研室（肖明）

朱堅勝，E-mail：zhujs@tzhospital.com