吡格列酮對大鼠冠狀動脈微栓塞后心肌損傷的影響

楊華鋒 李 浪 王現濤 劉 濤 劉陽春 陸元喜

廣西醫科大學第一附屬醫院心內科，廣西南寧 530021

冠狀動脈微栓塞（CME）指急性冠脈綜合征（ACS）患者動脈粥樣硬化斑塊自發性破裂后，斑塊碎片和脂質成分等致血栓成分流向遠端微小血管引起微循環堵塞，也是行經皮冠狀動脈治療（PCI）的常見并發癥[1]。CME 導致心肌損傷，易發生“慢血流”或“無復流”。 研究表明， 炎性因子參與的心肌組織局部炎性反應與CME 發生后心肌損傷密切相關[2]。 已證實，過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）激動劑的代表藥物吡格列酮可抑制體外培養心肌細胞的炎性反應，起保護心肌細胞效應[3]。 吡格列酮還能抑制大鼠心肌缺血/再灌注損傷[4-5]，因此，本研究觀察吡咯列酮預處理對大鼠CME 后心肌組織炎性因子的影響，探討PPARγ激動劑預防CME 致心肌損傷的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

42 μm 微栓塞球凍干粉（2×107個/g）購自挪威Dynal 公司；鹽酸吡格列酮片（杭州中美華東制藥有限公司，15 mg×7 片/盒，國藥準字H20050500，批號：140702）；兔抗腫瘤壞死因子-α（TNF-α）多克隆抗體、HRP 羊抗兔IgG 抗體購自北京博奧森生物公司；Trizol、反轉錄試劑盒購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 實驗動物模型的建立及分組

體質量200～250 g 的成年雄性SPF 級SD 大鼠，由廣西醫科大學實驗動物中心提供 （動物合格證號：SCXK 桂2014-0002）。 參照既往文獻方法[6]，10%水合氯醛2.5～3.0 mL/kg 腹腔注射麻醉大鼠， 頸正中切口暴露氣管，經口盲插入氣管導管，連接小動物呼吸機及心功能分析儀，輔助呼吸并監測心率。 開胸暴露心臟及大血管，分離升主動脈，血管夾鉗夾主動脈根部，微栓塞球0.1 mL（3×104個/mL，混懸于含十二磺基硫酸鈉的生理鹽水）經注射器由心尖部迅速注射至左心室，夾閉時間為10 s，待呼吸、心率正常后逐層關胸，自主呼吸恢復后拔管脫機。 將術后存活30 只大鼠隨機分為單純微栓塞組（CME 組）和吡格列酮預處理組（PIO 組），每組15 只。 另以等量生理鹽水替代微栓塞球行左心室注射的15 只大鼠為假手術組（S 組）。 PIO組術前連續7 d 給予吡格列酮10 mg/kg 灌胃，1 次/d。術畢所有動物均常規腹腔注射青霉素預防感染，飼養12 h 后處死。

1.3 RT-PCR 定量測定白細胞介素（IL）-6、IL-10 及TNF-α mRNA 表達

取心室組織0.2 g 并按Trizol 試劑盒說明操作提取心室肌總RNA，用Nanodrop 測量濃度后，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測示RNA 無降解后，調整RNA 濃度至1 μg/μL，行逆轉錄合成cDNA。SYBR GREEN Ⅰ熒光標記法檢測PCR 產物，反應體系為20 μL。本實驗特異性引物均由上海生工生物公司合成：IL-6 （229 bp）：上游：5'-CTGCTCTGGTCTTCTGGAGT-3'，下游：5'-GGTCTTGGTCCTTAGCCACT-3'。 IL-10（572 bp）：上 游：5'-ACGCTGTCATCGATTTCTC-3'， 下 游：5'-GCAAGTGAAAGGACACCAT-3'。 TNF-α（460 bp）上游：5'-TGGCCCAGACCCTCACA-3'， 下游：5'-TGCCCGGACTCCGTGAT-3'。 GAPDH（223 bp）：上 游：5'-GGCATTGCTCTCAATGACAA -3'， 下 游：5' -TGTGAGGGAGATGCTCAG-3'。 反應條件：94℃變性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸45 s，循環40 次。

1.4 Western blot 檢測TNF-α 表達

取心室肌組織0.5 g 以液氮研磨法研磨組織，轉移至EP 管， 加入蛋白裂解液與蛋白酶抑制劑，4℃下12 000 r/min 離心20 min，抽取上清液用BCA 法檢測蛋白濃度。 然后取50 μg 蛋白樣品，配制15%分離膠和5%濃縮膠， 聚丙烯酰胺凝膠電泳， 半干法轉膜35 min；含5%脫脂奶粉TBST 緩沖液封閉1 h；1︰200一抗4℃孵育過夜，TBST 洗膜后以相應二抗孵育1 h；增強化學發光法顯示抗原-抗體復合物， 暗室膠片顯影。用GelDoc 凝膠成像系統掃描。選擇GAPDH 蛋白作為內參。

1.5 統計學方法

采用SPSS 16.0 軟件統計分析，計量資料以均數±標準差（s）表示，采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠心肌IL-6、IL-10、TNF-α mRNA 表達水平比較

與S 組 比 較，CME 組 與PIO 組IL-6、IL-10、TNF-α mRNA 表達水平均升高， 差異有統計學意義（P ＜0.05）；與CME 組比較，PIO 組IL-6、TNF-α mRNA表達水平下降，IL-10 mRNA 表達水平升高， 差異有統計學意義（P ＜0.05）。 見圖1、表1。

圖1 各組大鼠心肌IL-6、IL-10 與TNF-α mRNA 表達水平比較

表1 各組大鼠心肌IL-6、IL-10 與TNF-α mRNA 表達水平比較（s）

表1 各組大鼠心肌IL-6、IL-10 與TNF-α mRNA 表達水平比較（s）

注：與S 組比較，*P ＜0.05；與CME 組比較，#P ＜0.05；IL-6：白細胞介素-6；IL-10：白細胞介素-10；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；S：假手術；CME：冠狀動脈微栓塞；PIO：吡格列酮

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2.2 各組大鼠心肌TNF-α 蛋白表達水平比較

與S 組（0.61±0.20）比較，CME 組（1.74±0.34）與PIO 組（1.21±0.46）的TNF-α 蛋白表達水平均升高，差異有統計學意義（P ＜0.05）；CME 組與PIO 組的TNF-α 蛋白表達水平比較差異有統計學意義 （P ＜0.05）。 見圖2。

3 討論

圖2 各組大鼠心肌TNF-α 蛋白表達水平比較

CME 發生后急性期易發生心肌損傷， 病理特征為局部微小心肌梗死灶，伴隨心肌標志物以及炎性因子升高，表現為灌流-收縮功能不匹配，冠脈血流儲備下降，血流動力學不穩定及惡性心律失常[7]。 CME 是影響ACS 患者預后及死亡率的獨立預測因素[1]。Skyschally 等[2]發現，心肌組織微梗死灶引起的炎性反應是CME 急性期導致心肌損傷的因素。

CME 后心肌炎癥損傷的顯著生化改變為炎性因子表達上調，且炎性因子對心肌收縮舒張功能起負性調節作用[8]。筆者在前期研究已證實，CME 發生后3 h，心肌組織局部炎性因子表達水平開始明顯升高并于12 h 達到高峰[9]。 因此，本研究選擇對CME 后炎性因子觀察時間點為12 h。

在正常生理情況下，TNF-α、 白介素等炎性因子在心臟中含量極微，僅由內皮細胞及位于心肌組織間質的巨噬細胞等免疫細胞產生；在應激損傷刺激等特殊狀態下，心肌細胞本身也可表達多種炎性因子。 研究發現，CME 后急性期顯著升高的炎性因子，主要由應激狀態心肌細胞本身分泌產生[10]。 TNF-α 是CME致心肌損傷的重要細胞因子。 急性期上調的TNF-α可直接抑制心臟收縮功能，激活中性粒細胞及血管內皮細胞并促進其表達黏附分子，引起中性粒細胞及淋巴細胞等免疫細胞在受損心肌組織局部募集，導致心肌組織炎癥級聯反應[11]。IL-6 是另一個重要的炎癥因子，Nessler 等[12]研究證實，心肌缺血后IL-6 表達增加，促進氧化應激，直接介導炎性反應。 表達上調的TNF-α 與IL-6 對缺血后心肌炎性反應起協同反應作用，兩者能破壞心肌微血管完整性，降低一氧化氮合成酶活性及腺苷生成，進一步加重微循環損傷[13]。 本研究檢測心肌組織IL-6 與TNF-α 水平，從生化角度間接反映CME 后炎性反應及心肌損傷程度。 本實驗中，大鼠CME 發生后心肌組織TNF-α 與IL-6 升高，客觀反映了CME 后12 h 心肌損傷情況，CME 組較PIO 組心肌炎癥損傷更嚴重， 提示吡格列酮對CME后心肌損傷有一定的保護作用。

IL-10 主要由Th2 與Treg 細胞分泌，在體內能抑制白介素及TNF-α 等炎性因子表達， 起拮抗炎性反應作用。 PPARγ 是屬于Ⅱ型核受體超家族成員的核轉錄因子，參與糖脂代謝的調節，也調控體內炎性反應[14]。 研究表明，作為PPARγ 激動劑的代表藥物，吡格列酮能減輕缺血/再灌注損傷， 保護內皮細胞而發揮保護心肌效應，且該效應獨立于糖脂代謝的調控功能[3，15]。 本實驗發現，與S 組比較，CME 組 及PIO 組IL-10 mRNA 均上升， 提示CME 發生后體內抗炎因子IL-10 基因受轉錄調控。 PIO 組術前7 d 連續予10 mg/（kg·d）吡格列酮預處理，與CME 組比較，IL-6 mRNA、TNF-α mRNA 及 蛋 白 表 達 水 平 降 低，IL-10 mRNA 水平增高， 說明吡格列酮減少CME 后急性期心肌組織炎性因子在轉錄及翻譯水平的表達，減輕炎性反應。 較CME 組升高的IL-10 mRNA，提示吡格列酮可能通過一系列復雜機制上調抗炎因子的轉錄水平，起心肌保護作用。 研究表明，PPARγ 激動劑能激活PI3K/Akt、內皮型一氧化氮合酶（eNOS）等促生存通路、并抑制核因子-κB、絲裂原活化蛋白激酶等介導炎性反應通路的激活而減輕炎性反應[3，16]，但上述通路是否參與吡格列酮對CME 后心肌組織炎性因子的表達調控，有待進一步研究證實。

綜上所述，吡格列酮預處理可通過下調炎性因子IL-6 與TNF-α 的表達， 升高抗炎細胞因子IL-10 水平，從而減少大鼠CME 后心肌組織炎性反應，這種作用可能由PPARγ 介導，為防治CME 后心肌損傷提供新的思路， 深入研究PPARγ 激動劑對炎性因子表達的調控機制將具有重要價值。

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