XpertMTB/RIF實(shí)驗(yàn)在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用

劉慧梅 顏學(xué)兵

1.徐州醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，江蘇徐州 221000；2.江蘇省徐州市傳染病醫(yī)院結(jié)核科，江蘇徐州 221000；3.徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院感染科，江蘇徐州 221000

結(jié)核病的有效控制關(guān)鍵在于對(duì)結(jié)核患者的快速檢測(cè)及治療。 傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室診斷方法存在諸多不足，如抗酸菌涂片鏡檢方法操作簡(jiǎn)便、快速、特異、經(jīng)濟(jì)，但靈敏性較低[1-2]；固體培養(yǎng)法價(jià)格較低廉，敏感性較涂片鏡檢法高，但耗時(shí)達(dá)數(shù)周；液體培養(yǎng)法雖然可以提高敏感度、縮短報(bào)告時(shí)間，但經(jīng)濟(jì)成本非常高[3-4]。因此尋找一種可以快速診斷結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室方法顯得非常重要[5]。近年來，利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增技術(shù)（Xpert MTB/RIF）實(shí)驗(yàn)逐漸受到國(guó)內(nèi)外廣泛關(guān)注。 該檢測(cè)方法國(guó)內(nèi)臨床應(yīng)用剛剛起步，缺乏對(duì)其診斷性能的報(bào)道。 本研究旨在對(duì)Xpert MTB/RIF 實(shí)驗(yàn)與T-spot 實(shí)驗(yàn)等檢測(cè)方法在結(jié)核病診斷中的臨床價(jià)值進(jìn)行對(duì)比研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2014 年10 月～2015 年5 月徐州市傳染病醫(yī)院結(jié)核科收治的237 例患者，分為結(jié)核組和非結(jié)核組，分別為195 例和42 例，診斷均符合中華結(jié)核病診治指南診斷標(biāo)準(zhǔn)。 結(jié)核組包括： 肺結(jié)核組160 例，男77 例，女83 例，年齡5～78 歲；肺外結(jié)核組35 例，男22 例，女13 例，年齡3～72 歲，主要包括結(jié)核性腹膜炎10 例、結(jié)核性腦膜炎3 例、骨結(jié)核3 例、淋巴結(jié)核6 例、腸結(jié)核7 例、腎結(jié)核3 例、女性生殖系統(tǒng)結(jié)核3 例。 非結(jié)核組42 例，主要是肺炎、肺癌等患者，男26 例，女16 例，年齡22～83 歲。

1.2 方法

囑咐患者清晨嗽口后用力咳出深部濃痰，一式3 份，一份用于結(jié)核分枝桿菌（MTB）培養(yǎng)，一份用于痰涂片檢查，一份用于XpertMTB/RIF 檢測(cè)。標(biāo)本收集的注意事項(xiàng)：①痰液標(biāo)本收集以清晨為最佳，因?yàn)樵摃r(shí)間段患者痰量多，含菌量多；②在醫(yī)生或護(hù)士指導(dǎo)下取樣，不得私自取樣；③囑咐患者漱口3 遍以上，以除去淺表固有細(xì)菌。 如果患者昏迷或無力咳嗽，不宜收集樣本，醫(yī)護(hù)人員應(yīng)該協(xié)助患者采取合適體位，叩背以使痰液松動(dòng)，再用吸痰器吸引，在吸痰器吸管中段搜集痰液，按吸痰法將痰液吸入集痰器內(nèi)。

1.3 結(jié)核感染T 細(xì)胞斑點(diǎn)（T-spot）、液體培養(yǎng)、Xpert MTB/RIF 及藥敏實(shí)驗(yàn)

T-spot 實(shí)驗(yàn)：采集肝素抗凝外周血5 mL，分離外周單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）放入包被γ-INF 抗體的微孔板，加入結(jié)核特異性抗原早期分泌靶向抗原（early se creting antigen target 6，ESAT-6）和培養(yǎng)濾過蛋白（culture filtrate protein 10，CFP-10）作為刺激原，溫箱培養(yǎng)24 h 后，洗去抗原致敏效應(yīng)T 淋巴細(xì)胞，加入生物素標(biāo)記的二抗，再經(jīng)酶聯(lián)顯色，在細(xì)胞因子分泌的地方形成斑點(diǎn)，通過記錄斑點(diǎn)讀數(shù)檢測(cè)結(jié)核特異抗原致敏效應(yīng)T 淋巴細(xì)胞數(shù)量。 結(jié)果判定：當(dāng)空白對(duì)照孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)為0～5 個(gè)時(shí)，任一實(shí)驗(yàn)孔斑點(diǎn)數(shù)減去空白孔斑點(diǎn)數(shù)≥6 個(gè)，結(jié)果為陽性；如果空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)＞6 個(gè)時(shí)， 任一實(shí)驗(yàn)孔斑點(diǎn)數(shù)≥空白孔斑點(diǎn)數(shù)的2 倍，結(jié)果同樣表明陽性結(jié)果；如果上述標(biāo)準(zhǔn)不符合且陽性質(zhì)控對(duì)照孔正常時(shí)，檢測(cè)結(jié)果為陰性。

液體培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)：在Ⅱ級(jí)生物安全操作柜中接種環(huán)刮取菌落，涂抹至羅氏培養(yǎng)基斜面，旋緊螺旋蓋，在渦旋振蕩器上振蕩10～20 s，制成均勻的菌液。靜置10 min 后，用吸管接種約0.1 mL 至中性羅氏培養(yǎng)及斜面上。 傳代后的培養(yǎng)基放置在36℃培養(yǎng)，每周觀察菌落生長(zhǎng)情況，于肉眼可見菌落出現(xiàn)后1～2 周進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。 制備菌液：在磨菌瓶中加入1～2 滴10%吐溫-80℃水溶液，用無菌吸管尖端刮取2～3 周新鮮菌落，置于磨菌瓶中。旋緊瓶蓋，在渦旋振蕩器上振蕩10～20 s。 靜置5 min，小心打開瓶蓋，加入約2 mL 滅菌生理鹽水，靜置片刻，使菌液中的大塊物質(zhì)沉淀。用無菌吸管吸取上部的菌液，約1 mL，轉(zhuǎn)移到另一無菌試管中，與標(biāo)準(zhǔn)買時(shí)比濁管比濁。 逐漸滴加滅菌生理鹽水，直至菌液濁與標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)媳葷峁芤恢拢吹玫? mg/mL的菌液。 接種：在無菌帶有螺旋蓋的試管中以無菌手法加入2mL 滅菌生理鹽水備用，每株待測(cè)菌準(zhǔn)備2 管。菌液靜置，帶顆粒或菌塊沉淀。 用22 SWG 標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)2 滿環(huán)1 mg/mL 的菌液，平移至2 mL 滅菌生理鹽水中，即稀釋成1×10-2mg/mL 菌液。 用同樣方法再進(jìn)行100 倍稀釋，即成1×10-4mg/mL 菌液。 用22 SWG標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)分別取1 滿環(huán)1×10-2mg/mL 和1×10-4mg/mL的菌液，用劃線法均勻接種菌量為1×10-4mg 和1×10-6mg。接種后的培養(yǎng)基直立放置于恒溫培養(yǎng)內(nèi)，36℃培養(yǎng)，培養(yǎng)4 周后報(bào)告結(jié)果。

標(biāo)本符合以下特點(diǎn)可直接用于藥敏試驗(yàn)：①出現(xiàn)肉眼可見菌落后1～2 周的新鮮菌落；②沒有其他污染菌共存；③涂片確認(rèn)為抗酸菌。

Xpert MTB/RIF 實(shí)驗(yàn)：以1：2 的比例，往痰液標(biāo)本中加入處理液，在渦旋振蕩器上渦旋振蕩15～30 s，室溫靜置15 min，使痰標(biāo)本充分液化。 再將混合液轉(zhuǎn)移至反應(yīng)盒中，將反應(yīng)試劑盒放入Gene Xpert 儀器（美國(guó)Cepheid 公司生產(chǎn)）中，按說明書進(jìn)行檢測(cè)，約2 h即可讀取結(jié)果。 結(jié)果判斷： 依照探針的循環(huán)閾值（Ct值），當(dāng)內(nèi)對(duì)照探針Ct 值≤38 時(shí)為陽性，反之則為無效， 提示標(biāo)本的DNA 提取不合格或含有PCR 抑制物。 5 個(gè)探針中至少2 個(gè)探針Ct 值≤38 即為檢測(cè)到MTB，可進(jìn)一步按照Ct 值對(duì)MTB 進(jìn)行半定量。Ct 值＜16 為高含量，Ct 值為16～22 為中等含量，Ct 值為22～28 為低含量，Ct 值＞28 為極低含量。 檢測(cè)利福平耐藥的基礎(chǔ)在于MTB 特異性分子信標(biāo)早期Ct 值和晚期Ct 值之差。 即△Ct 值。 系統(tǒng)設(shè)置的結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)為△Ct＞3.5 提示對(duì)利福平耐藥，△Ct＜3.5 提示對(duì)利福平敏感。由于終止循環(huán)數(shù)為38 個(gè)循環(huán)，因此當(dāng)早期探針Ct 值＞34.5 或晚期探針Ct 值＞38 時(shí)，利福平耐藥結(jié)果為不確定。 目前研究表明95%的利福平耐藥菌株在rpoB 基因81 bp 區(qū)域（RRDR）存在基因突變。

1.4 結(jié)果判定

1.4.1 痰涂片結(jié)果判定 按照中國(guó)防癆協(xié)會(huì)基礎(chǔ)專業(yè)委員會(huì)制訂的實(shí)驗(yàn)室檢查規(guī)程進(jìn)行[6-7]。①抗酸桿菌陰性（-）：連續(xù)觀察300 個(gè)不同視野，未發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌。②報(bào)告抗酸桿菌菌素：1～8 條/300 個(gè)視野。③抗酸桿菌陽性（+）：每100 個(gè)視野發(fā)現(xiàn)3～9 條抗酸桿菌。④抗酸桿菌陽性（++）：每10 個(gè)視野發(fā)現(xiàn)1～9 條抗酸桿菌。⑤抗酸桿菌陽性（+++）：每個(gè)視野發(fā)現(xiàn)1～9 條抗酸桿菌。 ⑥抗酸桿菌陽性（++++）：每個(gè)視野發(fā)現(xiàn)平均10 條抗酸桿菌。

1.4.2 藥敏結(jié)果判定 （-）：無菌落生長(zhǎng)；報(bào)告實(shí)際菌落數(shù)：＜50 個(gè)菌落；（+）：50～100 個(gè)菌落；（++）：100～200 個(gè)菌落；（+++）：大部分融合（200～500 個(gè)菌落）；（++++）：融合（＞500 個(gè)菌落）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher 確切概率法。 Kappa＞0.4，表示兩種實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)一致性結(jié)果較好；Kappa＜0.4，表示檢驗(yàn)結(jié)果一致性較差。以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Xpert MTB/RIF 實(shí)驗(yàn)與其他結(jié)核檢測(cè)方法的結(jié)果比較

結(jié)核組患者Xpert MTB/RIF 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)敏感性顯著高于液體培養(yǎng)（χ2=36.691，P = 0.000）和痰涂片（χ2=6.934，P = 0.008），與T-spot 比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.347，P=0.541）。非結(jié)核組4 種方法特異性均較高且差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.346、0.346、1.012，P=0.557、0.557、0.314）。基于入組情況將患者分為肺結(jié)核、肺外結(jié)核進(jìn)行分析，4 種檢測(cè)方法均表明肺結(jié)核組結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)敏感性（Xpert MTB/RIF、T-spot 痰涂片、液體培養(yǎng)）明顯高于肺外結(jié)核組（χ2=8.915、5.880、7.142、7.457，P = 0.003、0.015、0.008、0.006）。 見表1。

表1 結(jié)核敏感性及非結(jié)核特異性比較[n（%）]

2.2 Xpert MTB/RIF 實(shí)驗(yàn)與其他幾種檢測(cè)結(jié)果一致性的比較

Xpert MTB/RIF 實(shí)驗(yàn)與T-spot 實(shí)驗(yàn)檢出結(jié)果符合率為86.9%，一致性Kappa=0.737，一致性結(jié)果較好；Xpert MTB/RIF 實(shí)驗(yàn)與痰涂片檢出結(jié)果符合率為61.2%，一致性Kappa=0.200，一致性結(jié)果較差；Xpert MTB/RIF 實(shí)驗(yàn)與液體培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果符合率為78.5%，一致性Kappa=0.563，一致性結(jié)果較好。 見表2。

表2 Xpert MTB/RIF 實(shí)驗(yàn)與痰涂片和液體培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果一致性的比較（例，n=237）

2.3 利福平耐藥檢測(cè)結(jié)果

在237 例可疑結(jié)核患者中，液體培養(yǎng)陽性有85 例，9 例Xpert MTB/RIF 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)失敗，共76 例可進(jìn)行利福平耐藥檢測(cè)效能分析。傳統(tǒng)比例法藥敏實(shí)驗(yàn)檢測(cè)出耐藥菌9 株，耐藥率為11.8%（9/76）。比例法耐藥的的患者標(biāo)本中，XpertX 系統(tǒng)檢測(cè)出8 株為耐藥菌，敏感性為88.9%，比例法藥敏實(shí)驗(yàn)檢測(cè)敏感菌67 例中，有1 例Xpert 系統(tǒng)檢測(cè)出為耐藥菌，特異性為98.5%（66/67）。 見表3。

表3 利福平耐藥檢測(cè)結(jié)果（例，n=76）

3 討論

我國(guó)是世界上22 個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，結(jié)核病患者數(shù)量約500 萬例，居世界第二位，每年新增患者130 萬，死亡病例約13 萬例[8-11]。《2011 年中國(guó)衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)年鑒》資料顯示，在甲乙類法定報(bào)告?zhèn)魅静≈校覈?guó)現(xiàn)階段結(jié)核病發(fā)病率為74.27/10 萬，僅次于病毒性肝炎，位居第二，其死亡率為0.22/10 萬，僅次于艾滋病，亦位居第二，而且發(fā)病人群以青壯年為主[12]。 結(jié)核病的疫情控制與結(jié)核病的早期發(fā)現(xiàn)、合理規(guī)范治療、管理密切相關(guān)。 盡管結(jié)核病的診斷水平有了很大提高，但傳統(tǒng)的結(jié)核病診斷方法依舊存在很多不足之處，嚴(yán)重影響結(jié)核病的診斷工作開展。 Xpert MTB/RIF實(shí)驗(yàn)是針對(duì)結(jié)核分枝桿菌rpoB 基因利福平耐藥決定區(qū)設(shè)計(jì)引物、探針，檢測(cè)其是否發(fā)生突變[13-14]，2 h 內(nèi)即可診斷患者是否感染結(jié)核分枝桿菌以及耐藥性情況[15-16]。 本次研究旨在比較Xpert MTB/RIF 實(shí)驗(yàn)與其他3 種檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的效能，并以藥敏實(shí)驗(yàn)為金標(biāo)準(zhǔn)，分析其檢測(cè)利福平耐藥的應(yīng)用價(jià)值。

本研究采用可疑結(jié)核患者血液、痰標(biāo)本分別進(jìn)行T-spot 實(shí)驗(yàn)、Xpert MTB/RIF 實(shí)驗(yàn)、涂片鏡檢、液體培養(yǎng)以及傳統(tǒng)比例法藥敏實(shí)驗(yàn)檢測(cè)患者是否感染結(jié)核分枝桿菌及其對(duì)利福平耐藥情況。 結(jié)果顯示，以臨床診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert MTB/RIF 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌敏感性為56.9%，與國(guó)內(nèi)趙冰等[17]研究結(jié)果基本一致。 Xpert MTB/RIF 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌敏感性略高于T-spot 實(shí)驗(yàn)，明顯高于痰涂片鏡檢、液體培養(yǎng)。一致性檢驗(yàn)結(jié)果表明，Xpert MTB/RIF 實(shí)驗(yàn)與液體培養(yǎng)、T-spot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果一致性較好。

研究表明將Xpert MTB/RIF 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)利福平耐藥情況應(yīng)用于耐藥高危人群（耐藥率＞20%）中開展，檢測(cè)結(jié)果更具有價(jià)值[17]。 以比例法藥敏實(shí)驗(yàn)作為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert MTB/RIF 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)利福平耐藥的敏感性為88.9%，特異性為98.5%，與既往的研究[18-19]結(jié)果基本一致。但敏感性低于Boehme 等[20]研究結(jié)果。由于本次研究中76 例培養(yǎng)陽性標(biāo)本進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)， 耐藥率僅為11.8%，目標(biāo)人群利福平耐藥率較低，敏感性過低可能是由于利福平耐藥患者過少所致。因此世界衛(wèi)生組織建議如果在利福平耐藥率較低人群中應(yīng)用Xpert MTB/RIF 檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)利福平耐藥情況，檢測(cè)結(jié)果為耐藥，樣本仍需采用藥敏實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證Xpert檢測(cè)結(jié)果。

綜上所述，Xpert MTB/RIF 實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、敏感性高并且對(duì)實(shí)驗(yàn)室要求較低，因此可以很好的輔助臨床醫(yī)生及時(shí)診斷目標(biāo)疾病，具有一定的使用前景。

[1] 王永忠，柳龍銀，張宏宇，等.結(jié)核分枝桿菌實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[J].江蘇醫(yī)藥，2011，37（23）：2820-2822.

[2] 鄭強(qiáng)，李朝金，茍莉，等.多種肺結(jié)核臨床實(shí)驗(yàn)室診斷方法的比較分析[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2014，35（21）：2941-2942.

[3] 雷云.熒光PCR 診斷肺結(jié)核的臨床應(yīng)用研究[J].臨床肺科雜志，2014，19（7）：1278-1279.

[4] 張玉平，丁顯平，張麗嬡，等.T-SPOT、TB、痰涂片和TBDNA 檢測(cè)在肺結(jié)核診斷中的比較研究[J].成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，8（1）：49-51.

[5] 楊新明，鄒文瑋.不同方法檢查痰中結(jié)核桿菌的結(jié)果及分析[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2010，2（3）：303-304.

[6] 劉建君.中國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃痰涂片鏡檢質(zhì)量保證手冊(cè)[M].北京：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，2004：5-19.

[7] 趙雁林，王黎霞.分枝桿菌分離培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊(cè)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2013：3-12.

[8] WHO. The stop TB strategy，case reports，treatment outcomes and estimates of TB burden [R]. Geneva，2009.

[9] 王黎霞.中國(guó)結(jié)核病防治工作現(xiàn)狀分析[J].中國(guó)公共衛(wèi)生，2012，（4）：413-414.

[10] WHO.Global tuberculosis control[R].WHO report，2011.

[11] WHO. The global plan to stop TB 2011-2015：transforming the fight towards elimination of tuberculosis [R].Geneva：World health Organization，2010.

[12] Zhao YL，Xu SF，Wang LX，et al. National survey of drugresistant tuberculosis in china [J]. N IngI J Med，2012，366（23）：2161-2170.

[13] Nicol MP，Workman L，Isaacs W，et al. Accuracy of the Xpert MTB/RIF test for the diagnosis of pulmonary tuberculosis in children admitted to hospital in Cape Town，South Africa：a descriptive study [J]. Lancet Infect Dis，2011，11（11）：819-824.

[14] Marlowe EM，Novak-Weekley SM，Cumpio J，et al. Evaluation of the Cepheid Xpert MTB/RIF assay for direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex in respiratory specimens [J]. J Clin Microbiol，2011，49（32）：1621-1623.

[15] 夏輝，趙雁林.Xpert MTB/RIF 在我國(guó)的應(yīng)用前景[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2013，29（23）：3799-3800.

[16] 李力韜，李洪敏，馬遠(yuǎn)征，等.應(yīng)用XpertMTB/RIF 對(duì)脊柱結(jié)核臨床標(biāo)本行結(jié)核分枝桿菌與利福平耐藥性檢測(cè)的驗(yàn)證性研究[J].中華骨科雜志，2014，34（2）：211-215.

[17] 趙冰，歐喜超，夏輝，等.Xpert MTB/RIF 檢測(cè)技術(shù)在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用評(píng)價(jià)[J].中國(guó)防癆雜志，2014，36（6）：462-466.

[18] 張治國(guó)，歐喜超，孫倩，等.利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌及其耐藥性的研究[J].中國(guó)防癆雜志，2013，35（1）：13-15.

[19] 伊惠霞，侯新月，王泉，等.Xpert MTB/RIF 系統(tǒng)快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌及利福平耐藥性研究[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，37（12）：1643-1646.

[20] Boehme CC，Nabeta P，Hillemann D，et al. Rapid molecular detection of tuberculosis and rifampin resistance [J].N Eng J Med，2010，363（11）：1005-1015.