新疆北部棉鈴蟲寄主來源與轉基因棉區庇護所評估

李 娜, 張 娟, 劉永健, 張 豹, 熊建喜, 王佩玲,*, 呂昭智

1 石河子大學農學院植保系, 石河子 832003 2 147團農業科植保站, 石河子 832045 3 121團農機推廣站, 石河子 832066 4 中國科學院新疆生態與地理研究所, 中國科學院干旱區生物地理與生物資源重點實驗室, 烏魯木齊 830011

新疆北部棉鈴蟲寄主來源與轉基因棉區庇護所評估

李 娜1, 張 娟4, 劉永健2, 張 豹3, 熊建喜3, 王佩玲1,*, 呂昭智4

1 石河子大學農學院植保系, 石河子 832003 2 147團農業科植保站, 石河子 832045 3 121團農機推廣站, 石河子 832066 4 中國科學院新疆生態與地理研究所, 中國科學院干旱區生物地理與生物資源重點實驗室, 烏魯木齊 830011

轉Bt基因抗蟲棉長期大規模種植后，棉鈴蟲對其存在抗性風險，庇護所是延緩抗性上升的策略之一。但在新疆北部轉基因棉區，庇護所提供敏感棉鈴蟲的生態功能尚未見評估。2013年5—9月期間在新疆北部石河子地區147團、121團利用棉田邊緣的智能測報燈收集棉鈴蟲成蟲，應用碳穩定同位素技術從群體水平(混合翅膀)分析蟲源性質，從個體水平(雌蛾翅膀和對應精包)確定交配類型；同時通過解剖雌性棉鈴蟲體內的精包數量評估交配頻率。結果表明：來源于C4植物的棉鈴蟲主要出現在5月下旬和8—9月期間，比例占到50%左右；6—7月接近100%的棉鈴蟲來自于C3植物上；經測定不同寄主來源棉鈴蟲的有效交配比例為10%左右；兩個地方的棉鈴蟲交配頻率一般在0.9—2.1 次，但121團的第一代和第二代均高于147團。玉米是新疆北部地區重要的庇護所，但C3和C4來源棉鈴蟲同存的時間比較短，有效交配比例相對比較低，影響了庇護所的抗性稀釋能力。在轉基因棉區的抗性管理中不僅要考慮庇護所提供敏感棉鈴蟲數量大小，同時需要考慮有效交配比率，這將有利深刻理解庇護所生態功能。

碳穩定同位素技術; 棉鈴蟲; 害蟲抗性管理; 庇護所

轉Bt(Bacillusthuringiensis)抗蟲棉自1997年在我國商業化種植以來，對我國棉區棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)種群數量和危害有顯著的抑制作用[1-3]，但在轉Bt抗蟲棉大面積使用推廣過程中，存在著一系列潛在的環境安全問題，尤其是害蟲對Bt毒蛋白的抗性風險[4-7]。為了有效地延緩Bt抗性上升，Bt毒蛋白在轉基因作物中高效表達、雙價基因及庇護所等技術和策略已經在生產中實施與推廣[8]。

庇護所是在田間應用比較成功的的抗性治理策略之一[9-11]。美國、澳大利亞等國家普遍采用庇護所的方法進行抗性治理[9]，種植戶必須種植一定比例的非轉基因抗蟲棉或其它作物作為棉鈴蟲的庇護所：(1)在轉基因棉田中設立4%面積的常規棉且不使用殺蟲劑；(2)80%的轉Bt抗蟲棉與20%的使用農藥的常規棉[9, 12-14]。在我國黃河流域和長江流域抗蟲棉區，實施的“零庇護所策略”[15]，農田結構多樣地種植玉米、小麥、大豆和花生等寄主作物可培育敏感的棉鈴蟲，從而起到天然庇護所作用[16-18]。

如何在農田景觀尺度上分辨不同比例蟲源(特別是來源于抗蟲棉與庇護所)是評估和設計庇護所的核心。穩定同位素技術為農田系統中多食性害蟲蟲源分析提供了有效的途徑，特別是幼蟲期的寄主來源不同。棉鈴蟲成蟲的碳穩定性同位素數據可以反映棉鈴蟲幼蟲取食寄主類型：取食C3植物(棉花)與C4植物(常見為玉米)的棉鈴蟲翅具有不同范圍的δ13C值，兩者之間并無重疊區域[19]。Baker[20]采用碳穩定性同位素證實了澳大利亞來自于C4植物的棉鈴蟲達到50%以上，同時也證明了來自于棉花和庇護所的棉鈴蟲之間的交配是隨機的。葉樂夫[21-22]通過碳穩定同位素技術分析了河北棉區第三代棉鈴蟲來源于C4植物(玉米)的比例為40.5%—56.8%，但是來自于C4植物的棉鈴蟲與來自于C3植物的在時間上存在著交配非同步性[21]；越冬代棉鈴蟲來自于C3和C4植物的比例也是接近的，但實驗中測定棉鈴蟲的數量是比較有限的[22]。新疆綠洲島嶼化分布、作物景觀均質(很多區域70%以上是棉花)、耕作制度單一，在一定程度上決定了抗性風險高于內地以小農戶種植為主的抗蟲棉地區，已有研究表明了新疆部分區域棉鈴蟲的抗性基因頻率呈上升趨勢[23]，可見庇護所評估問題對該地區抗性治理尤為迫切。

轉基因抗蟲棉在新疆種植已有10余年，國內對新疆地區棉鈴蟲抗性監測、潛在庇護所評估等研究相對較少[24-27]。本試驗以棉鈴蟲抗性管理的生態學措施為背景，以棉鈴蟲寄主來源和交配選擇為研究主線，評估新疆北部農田系統對棉鈴蟲抗性管理。

1 材料與方法

1.1 試驗地點

選擇新疆北部石河子地區的147團和121團兩個試驗點，兩地點相距60 km。147團(86°6′E，44°35′N)棉花占總耕地面積的80%，玉米多以10—20 hm2為種植單元，占總耕地面積的5%；121團(85°35′E，44°49′N)棉花占耕地面積的90%，玉米主要以條帶方式在棉田邊緣種植(寬度為1.5 m)，占耕地面積的2%。

1.2 試驗方法

1.2.1 收集方法

采用頻振式殺蟲燈(PS-15-2，佳多科工貿有限責任公司)誘集棉鈴蟲成蟲。于2013年5月—9月在越冬代、第一代、第二代棉鈴蟲成蟲發生期分別收集147團棉鈴蟲成蟲，每代棉鈴蟲各收集7 次，每隔2d采集1次，每個收集日內誘集到的棉鈴蟲成蟲浸泡在95%酒精里，貼好標簽帶回實驗室進行分析。121團沒有收集越冬代棉鈴蟲，在第一代、第二代棉鈴蟲發生期每天都進行收集。棉鈴蟲動態監測數據來自147團測報站。

1.2.2 棉鈴蟲雌性生殖系統解剖及測試樣品準備

隨機挑取每代棉鈴蟲每個收集日期內的雌蛾30 頭，解剖生殖系統，撥出交配囊，挑出精包，再將每個雌蛾的左前翅和精包一一對應，放入1.5 mL的離心管中，在95%的酒精里進行保存，做好標記備用。

隨機挑取每代棉鈴蟲每個收集日期內的雄蛾，每個日期內均取50 頭雄蛾的左前翅混合成1個樣品放入5 mL的離心管中，在95%的酒精里進行保存備用。

1.2.3 碳穩定同位素檢測

(1) 測定儀器

本實驗所測定的樣品統一編號送北京巴斯特防治荒漠化科技研究所進行碳穩定同位素測定。

碳穩定同位素比值測定儀器:主機型號：DELTA V Advantage 同位素比率質譜儀(Isotope Ratio Mass Spectrometer)元素分析儀(Thermo Fisher Scientific, Inc., USA.)

研磨樣品使其均勻，樣品在元素分析儀中高溫燃燒后生成CO2，質譜儀通過檢測CO2的13C與12C比率，并與國際標準物(Pee Dee Beleminite或PDB)比對后計算出樣品的δ13C比率值。測定精度：δ13C ± <0.1%。

(2) 棉鈴蟲蟲源性質測定

單個測樣的樣本較多，測試費用昂貴，因此采用群體測樣的方法對所取的每個收集日期的雄蛾混合翅做為一個樣本進行碳穩定同位素分析。147團共23個樣，121團共25個樣。

(3) 標準曲線的制作方法

將初孵化的棉鈴蟲幼蟲分別移入常規棉花(C3作物)和玉米(C4作物)上，在這些植物上飼養并得到蛹，將蛹分別收集并等待羽化為蛾，在兩種植物上各取250 頭成蟲，分別取左前翅，按照C3∶(C3+C4)=0%；25%；50%；75%；100%的比例混合，分析這5 個混合樣的碳穩定性同位素值，繪制棉鈴蟲翅的碳穩定性同位素校準曲線。來自于不同寄主的棉鈴蟲翅的混合比例如下：

1)比例0% 來自于C3植物的棉鈴蟲翅0 只，來自于C4植物的棉鈴蟲翅100 只；

2)比例25% 來自于C3植物的棉鈴蟲翅25 只，來自于C4植物的棉鈴蟲翅75 只；

3)比例50% 來自于C3植物的棉鈴蟲翅50 只，來自于C4植物的棉鈴蟲翅50 只；

4)比例75% 來自于C3植物的棉鈴蟲翅75 只，來自于C4植物的棉鈴蟲翅25 只；

5)比例100% 來自于C3植物的棉鈴蟲翅100 只，來自于C4植物的棉鈴蟲0 只。

(4) 不同植物來源棉鈴蟲交配

根據1.2.3(2)所群體所測定的棉鈴蟲的蟲源性質，選擇147團C4來源比例大的5月20日、7月30日、8月5日的雌蛾，再分別單個測定已經解剖好的(見1.2.2)30頭棉鈴蟲雌蛾左前翅和對應精包的δ13C值，明確雌蛾和與其交配雄蛾的寄主來源，即可得棉鈴蟲的不同交配類型比例，類型分為C3(雌)×C3(雄)；C3(雌)×C4(雄)；C4(雌)×C3(雄)；C4(雌)×C4(雄)，測定方法見1.2.3.1，測試結果參考Gould[19]以及葉樂夫[21-22]等對棉鈴蟲成蟲翅的測定數據，來自C4植物寄主(如玉米、高粱等)的穩定同位素比值位于(-17.013)—(-12.382)范圍，來自于C3植物(如棉花、小麥等)穩定同位素比值位于(-31.061)—(-22.759)范圍。

(5) 棉鈴蟲交配頻率監測

棉鈴蟲交配囊內精包柄有幾根表明交配幾次[28]，如果精包柄在解剖中被拉斷，即可撕開交配囊體，檢查精包殘體數，記錄棉鈴蟲交配次數。

1.3 數據處理

應用Microsoft Office Excel2003、Origin8.5處理圖形和回歸方程；交配頻率=雌成蟲總交配次數/雌成蟲總量。

2 結果與分析

2.1 棉鈴蟲田間動態

棉鈴蟲在新疆北部每年發生3 代。147團2006—2012年燈下蛾量的平均值表明：越冬代成蟲發生期為5月6日—6月10日，高峰期在5月23日左右；第一代成蟲發生期為6月15日—7月15日，高峰期在6月28日左右；第二代成蟲發生期為7月20日—9月10日，高峰期在8月5日左右。2013年智能測報燈下棉鈴蟲成蟲，高峰期分別為：越冬代在5月20日，第一代在6月30日，第二代在8月6日(圖1)。

圖1 147團棉鈴蟲成蟲種群動態圖Fig.1 Population dynamics of H.armigera in 147th regiment in Northern Xinjiang

2.2 棉鈴蟲蟲源分析

2.2.1 標準曲線的計算結果

所建立的標準曲線為：y=-11.04-0.13x(R2=0.9824,P<0.0001)，式中，y是每個日期內群體樣所測定δ13C值，x是C3所占的比例(圖2)。將群體所測定的值(y)代入此方程，便能計算出來源C3植物棉鈴蟲的比例(x)。

2.2.2 棉鈴蟲的蟲源性質

2013年在6月1日—7月26日之間147團和121團棉鈴蟲均為C3來源比例高(達95%)，C4比例較少(5%)，但147團6月16日的棉鈴蟲C4來源比例為54.46%。5月下旬，147團棉鈴蟲C4來源比例為46.29%，C3來源比例為53.71%；8月上旬,147團C4來源的比例58.10%，C3比例41.90% 9月份C4來源比例53.74%，C3比例46.26%，均是C3和C4比例相當，而121團C3來源比例為95.69%，C4比例為4.31%(圖3)。

圖2 棉鈴蟲翅的碳穩定性同位素校準曲線 Fig.2 Calibration curves for the percentage of C3 vs.C4-derived H.armigera moths

圖3 2013年新疆北部地區田間棉鈴蟲成蟲C3比例 Fig.3 Percentage of H.armigera adults derived C3 hosts in the fields in Northern Xinjiang in 2013

2.3 棉鈴蟲交配選擇

2.3.1 不同寄主來源棉鈴蟲交配選擇

147團棉鈴蟲交配情況如圖4所示，2013年5月20日C3來源比例為75.8%，C4來源比例為24.2%,(C3∶C4比例接近3∶1);而棉鈴蟲C4來源和C3來源的交配比例為8.89%，C4和C4來源交配比例為2.22%，同為C3來源的交配比例為88.89%。7月30日棉鈴蟲C3來源比例為46.33%，C4來源比例為53.67%,C3∶C4比例接近1∶1;而棉鈴蟲C4來源和C3來源的交配比例為13.33%，C4和C4來源交配比例為6.67%，同為C3來源的交配比例為80.00%；8月5日棉鈴蟲，C3來源比例為36.74%，C4來源比例為63.26%，C3∶C4比例接近1∶1.5;而棉鈴蟲C4來源和C3來源的交配比例為8.33%，同為C3來源的交配比例為是91.66%(圖4)。

圖4 田間不同來源棉鈴蟲的交配情況Fig.4 Mating of H.armigera from different host plant in the fields

2.3.2 棉鈴蟲交配頻率

2013年新疆北部石河子地區兩試驗點棉鈴蟲交配頻率如下：121團第一代棉鈴蟲平均交配頻率為(1.43±0.40) 次/頭，147團棉鈴蟲平均交配頻率為(1.0±0.56)次/頭；第二代棉鈴蟲121團棉鈴蟲平均交配頻率為(2.13±0.31) 次/頭，147團棉鈴蟲平均交配頻率為(0.93±0.21) 次/頭(表1)。 121團棉鈴蟲交配頻率在第一代和第二代均高于147團。

兩地棉鈴蟲在高峰期交配頻率一般可達到最大，但147團第二代高峰期8月5日例外，147團越冬代高峰期5月23日為2.8 次/頭；第一代高峰期7月3日為2 次/頭；第二代7月24日最大為2.2 次/頭，高峰期8月5日為1.1 次/頭。121團第一代雌蛾有兩個高峰期為6月26日為1.9 次/頭和7月2日為2.3 次/頭，第二代棉鈴蟲的交配最高可達2.8 次/頭(圖5)。

圖5 棉鈴蟲交配頻率動態圖Fig.5 Dynamics of mating frequency of H.armigera

3 討論

(1) 棉鈴蟲遷飛性與其蟲源性質

Head研究表明：在美國棉區5個州阿肯色州、密西西比、格魯吉亞、北卡羅萊納州、路易斯安那州來源于C4植物的棉鈴蟲主要出現在6月中旬到7月中旬[29]，Gould研究結果表明：在路易斯安那州棉鈴蟲來源于C4植物主要出現在5月、8月和9月[19]，結果不同可能與當年棉鈴蟲存在遷飛有關。本試驗結果表明：在2013年新疆北部棉區147團來源C4植物的棉鈴蟲主要出現在5月、8月和9月，盡管121團沒有越冬代的數據，但在6—7月期間，棉鈴蟲寄主來源與147團相似，C4的比例很少，小于5%。在新疆北部棉區玉米主要在次年5月和當年8、9月為棉鈴蟲提供庇護所，在6—7月間玉米庇護所對敏感性棉鈴蟲貢獻很小，Lü的研究也表明在新疆玉米是第二代棉鈴蟲的主要寄主[30]，與本研究結果一致。147團6月16日出現了大量C4植物來源的棉鈴蟲，可能是遷飛而來，而7月30日的棉鈴蟲可能是近距離擴散而來。在2013年的連續動態解剖棉鈴蟲卵巢也表明了棉鈴蟲在新疆1—2代中存在大量的遷入種群(未發表)，張娟的研究也表明了棉鈴蟲在新疆北部地區存在遷飛性[31]。

(2) 交配頻率與有效交配

121團和147團棉鈴蟲交配情況不同(圖4和表1)。121團第一、二代棉鈴蟲交配頻率高于147團，這可能與同一寄主上棉鈴蟲發育比較整齊有關，因為147團種植5%飼料或者食用玉米，均為結構性庇護所種植，并且在玉米上化學殺蟲劑使用較少，該區域棉鈴蟲主要來源于玉米和棉花；而121團玉米種植比例<2%，采用誘集帶種植模式，多采用化學方法防治玉米上的螨類，棉鈴蟲主要來源于棉花，發育相對比較整齊。張娟[31]2010和2012年的數據也表明棉鈴蟲交配率在作物相對復雜的農田比較低，與本研究結果是一致的。玉米上棉鈴蟲的發育歷期、成蟲羽化期比棉花上的長2d左右[32]，因此本實驗結果中147團交配頻率低可能是來自棉花和玉米上的棉鈴蟲發育不同步，交配時間不能完全配合造成的。本研究中沒有測定121團越冬代棉鈴蟲來源的差異及其交配情況，有待于進一步研究。

(3) 提高庇護所功能的措施

轉基因抗蟲棉在新疆大規模種植，可制定法規強制農戶和企業種植一定面積的玉米，為抗蟲棉區域提供足夠數量的敏感棉鈴蟲，延緩抗性產生；另外可種植其它種類的植物如鷹嘴豆等非轉基因植物作為棉鈴蟲的寄主，增加一定數量的敏感品系棉鈴蟲數量[27]，應進一步研究作物結構復雜性對棉鈴蟲發育同步性的影響，優化設計新疆庇護所種植模式，實現棉鈴蟲對轉基因棉花抗性的持續治理。

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Analysis of Larval host types of Cotton Bollworm (Helicoverpaarmigera) Populations for Evaluation of Bt Refuges in Northern Xinjiang

LI Na1, ZHANG Juan4, LIU Yongjian2, ZHANG Bao3, XIONG Jianxi3, WANG Peiling1,*, Lü Zhaozhi4

1DepartmentofPlantProtection,CollegeofAgriculture,ShiheziUniversity,Shihezi832003,China2The147thplantprotectionstationofAgricultrationDepartment,Shihezi832045,China3The121thProductionandConstructionCropsAgriculturalTechnologyExtensionStation,Shihezi832066,China4XinjiangInstituteofEcologyandGeography,ChineseAcademyofSciences,KeyLaboratoryofBiogeographyandBioresourceinAridLand,ChineseAcademyofSciences,Urumqi830011,China

Transgenic cotton, expressing an insecticidal toxin fromBacillusthuringiensis(Bt cotton), has been widely cultivated for a long period in some areas of China. Therefore, there is the potential for the cotton bollworm,Helicoverpaarmigera, to develop resistance to Bt cotton toxins. The United States Environmental Protection Agency (US EPA) is rethinking the requirement for some regions to delay developing natural refuge crops where Bt cotton growth has been highly successful. The policy of establishing refuges was intended to delay pest population development of Bt-toxin resistance. Bt cotton is widely grown in Xinjiang Province, which is the largest cotton-producing area in China, but no studies have been conducted on potential refuges in this region of China. In recent years, stable carbon isotope techniques (δ13C) have been used to identify the larval host-types (i.e., whether the hosts are C3or C4plants) of cotton bollworm. These methods have been used to evaluate the Bt refuge function of non-cotton crops.In this study, intelligent forecast light traps were established to collect adult cotton bollworms from May to September 2013, from the 147thand 121stregiments of the Shihezi reclamation area located in northern Xinjiang. The captured moths were placed into bottles and preserved in 95% alcohol until analysis. At each of the sites, 50 males and 30 females moths were selected on the day of capture, their wings combined into two bulked samples respectively to analyze their host type (C3or C4) using δ13C analysis. At the same time, 30 female′s wings and corresponding spermatophore were separated to one single sample to analyze the mating type and percentage of mating frequency between C3and C4host. A total of 23 bulked samples from the 147thregiment and 25 bulked samples from the 121stregiment were tested. The proportions of C3and C4hosts were calculated according to a standard curve constructed in 2012. Approximately 50% of cotton bollworms were derived from C4hosts, and approximately 50% from C3hosts in late May and from early August to September. From June to July, 100% of cotton bollworms were derived from C4hosts. To evaluate the mating frequency of cotton bollworms at the two sites, we selected 210 anatomically adult females in the 1stand 2ndgenerations from the 147thand 121stregiments. The percentage of effective mating between the two larval host-types (C3and C4) was approximately 10%. Mating frequency ranged from 0.9 to 2.1 per adult female at the two sites, and was higher at the 121stregiment site than at the 147thregiment site. Maize is considered to be the most important natural refuge for Bt-susceptible cotton bollworms in northern Xinjiang, since maize is the main C4host plant in this area. Thus, maize may provide refuges for susceptible cotton bollworms in the autumn of one year and the spring of the following year. There is a short period in which cotton bollworms derived from C3and C4hosts simultaneously co-exist, and there is a very small percentage of effective mating between cotton bollworms derived from C3and C4hosts. This will affect the capacity to dilute the Bt-resistance in cotton bollworms, and may be related to the non-synchronization of C3and C4crops and male and female cotton bollworms.

carbon stable isotope;Helicoverpaarmigera; insect resistance management; refuge

國家國際科技合作專項(2011DFA33170); 中國科學院院地合作專項(XBXJ-2011-029)

2014-02-16; < class="emphasis_bold">網絡出版日期:

日期:2014-12-04

10.5846/stxb201402160266

*通訊作者Corresponding author.E-mail: wangpl69@126.com

李娜, 張娟, 劉永健, 張豹, 熊建喜, 王佩玲, 呂昭智.新疆北部棉鈴蟲寄主來源與轉基因棉區庇護所評估.生態學報,2015,35(19):6280-6287.

Li N, Zhang J, Liu Y J, Zhang B, Xiong J X, Wang P L, Lü Z Z.Analysis of Larval host types of Cotton Bollworm (Helicoverpaarmigera) Populations for Evaluation of Bt Refuges in Northern Xinjiang.Acta Ecologica Sinica,2015,35(19):6280-6287.