柿EST—SSR標記在柿屬植物中的通用性研究

羅純　張青林　羅正榮

摘要：公共數據庫和柿轉錄組測序產生的大量EST序列為開發新的SSR標記提供了有效資源。我們在前期利用這些數據開發出112個EST-SSR標記，此次研究選用其中11個標記對柿屬（Diospyros L.）15個種20份試材進行了標記通用性檢測。結果表明，所有引物均能擴增出產物，多態性引物比率達100%，并且UPGMA聚類結果可靠，說明柿EST-SSR標記在近緣種中可以通用。上述通用性標記為柿屬植物遺傳多樣性研究提供了標記資源。

關鍵詞：柿屬植物（Diospyros L.）；EST-SSR標記；通用性

中圖分類號：Q949.775.3；Q943.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）22-5434-04

簡單重復序列（Simple sequence repeats，SSR）分子標記技術通常又稱為微衛星標記（Microsatellites），它是指以1～6個核苷酸為單位多次串聯重復的DNA序列。與其他分子標記技術相比，SSR標記具有多態性高、共顯特性、易用聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR）檢測、重復性強、數量豐富和對基因組有很好的覆蓋性等特點[1]。根據SSR的來源可將其分為基因組SSR和表達序列標簽（Expressed sequence tag，EST）-SSR。EST是來自隨機選取的特定處理的cDNA克隆末端序列，能反映mRNA的信息，在功能基因組研究中具有重要意義。EST-SSR與基因組SSR標記相比，具有不同物種間通用性較好、開發方法簡單及成本低廉等優點[2]。而且EST-SSR標記來自于基因的編碼序列，更容易獲得基因表達的信息，所以現在已成為重要的農作物農藝性狀定位、遺傳作圖、遺傳多樣性、比較基因組學研究的新型工具。目前，大麥（Hordeum vulgare L.）[3]、小麥（Triticum aestivum L.）[3]、油菜（Brassica campestris L.）[4]、柑橘（Citrus reticulata Blanco）[5]等許多農作物已從公共數據庫中成功地開發出了大量的EST-SSR標記。

柿（Diospyros kaki Thunb.）是柿科（Ebenaceae）柿屬（Diospyros L.）植物中作為果樹栽培的代表種，其栽培歷史已有二千余年。中國是柿屬植物的分布中心和原產中心之一，擁有豐富的種質資源。目前，已利用多種分子標記技術對柿屬植物進行了遺傳分析，如Du等[6]在柿上開發了反轉座子標記，Guo等[7]利用簡單序列重復區間擴增多態性（Inter-simple sequence repeat，ISSR）技術開發了SSR標記。我們也開發了EST-SSR和靶位區域擴增多態性（Target region amplified polymorphism，TRAP）標記[8，9]，并在柿品種間進行了遺傳分析，但是這些標記對于柿屬其他種植物是否能通用尚需進一步試驗。本研究利用前期開發的11個EST-SSR標記對柿屬15個種20份試材進行了標記通用性評價，旨在為柿及其近緣種種質鑒定及遺傳多樣性分析提供實用、高效的研究工具。

1 材料與方法

1.1 材料和模板DNA的提取

利用柿屬15個種的20份材料（表1）進行標記通用性評價。采用CTAB法提取材料基因組DNA，參照程運江等[10]的方法并作適當改動。試驗所用引物序列基本信息見表2。

1.2 擴增反應體系

PCR反應體系20 μL，其中包括：1×Buffer，20 ng DNA 模板，1.5 mmol/L MgCl2，0.1 mmol/L dNTPs，0.8 μmol/L 引物，1 U Taq酶。擴增反應是在德國Biometra TProfessional PCR儀上進行，擴增程序如下：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性45 s，55 ℃（不同引物退火溫度不同）復性1 min，72 ℃延伸75 s，35個循環；72 ℃延伸5 min。試驗所用引物序列的基本信息及各引物退火溫度見表2。

1.3 凝膠電泳及銀染

SSR擴增產物通過6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后進行銀染[11，12]，用數碼相機拍照保存電泳圖譜。根據圖譜分析各EST-SSR位點的擴增情況，包括是否擴增、各位點在不同種中所得到的等位基因數量，根據DNA分子量標準估算等位基因片段的大小。

1.4 遺傳多樣性分析

對11個柿EST-SSR位點在20份柿近緣種中的擴增結果DNA譜帶進行數字化統計，有帶的位置記為1，無帶的位置記為0。將所有試驗數據在Microsft Office Excel 2003軟件里進行標準化處理，利用NTSYSpc 2.10e分析軟件構建數據矩陣；在Simint程序下選擇Dice系數計算20份柿近緣種間的遺傳相似系數，采用非加權組平均法（Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）建立相應的系統樹狀樹，通過聚類劃分類群來完成聚類分析。

2 結果與分析

2.1 柿EST-SSR引物在柿近緣種中的擴增結果

11對柿EST-SSR引物在20份柿近緣種中的擴增結果分別見表3、圖1。由表3可以看出，在所有的11對EST-SSR引物中，以引物1430、5845與5553的通用性最高，可在所有20份柿近緣種材料中得到擴增片段；而其他8對引物都在某些材料中沒有擴增產物出現，如引物460在麗江君遷子1以外的其他近緣種中都得到了擴增產物；引物6665也有較高的通用性，除了在麗江君遷子1和麗江君遷子4中沒有得到擴增產物外，在其他的近緣種中都得到了清晰的擴增條帶。引物8125、4379和9004在3個近緣種中無擴增產物。引物1554、6615、8917在4個近緣種中無擴增產物，通用性稍低。

2.2 EST-SSR擴增圖譜分析

對11個EST-SSR位點在20份柿屬植物中的擴增圖譜（圖1）進行分析。結果表明，在擴增與否和各位點擴增的等位基因數量方面，不同種間存在著差異。從EST-SSR位點的擴增情況來看，麗江君遷子1除了引物1430、5845、8125和5553可得到目的擴增產物外，在其他7個位點中均無擴增產物，可擴增位點較少；烏材、麗江君遷子4和麗江君遷子6分別得到7、6、7個可擴增位點；青茶柿、象牙樹、麗江君遷子3和苗山柿各自除一個位點外，其他10個位點均能有效擴增；其他12份近緣種材料在所供試的EST-SSR位點均有目的產物擴增出來。

從表3各EST-SSR位點所得到的等位基因數目來看，各近緣種所得到的等位基因數目差異較小。各個近緣種材料在8917、1430位點上擴增得到的等位基因數較多，其中，嶺南柿在8917位點上得到等位基因數目最多，為8個。位點1554所表現的多態性較低，除黑皮柿和青茶柿分別擴增出2個和3個等位基因外，所檢測的其他材料在該位點上表現為單態或無擴增。

2.3 UPGMA聚類分析

20份柿近緣種EST-SSR分析的UPGMA聚類分析結果見圖2。從圖2可見，由于試驗材料是柿屬中不同的種，除各類君遷子外，其他種間的相似系數都比較低。所有材料中，最大的Dice相似系數為0.909（麗江君遷子3和麗江君遷子5之間），最小的為0.059（烏材和嶺南柿之間）。烏材與供試其他材料之間的相似系數均很小，說明烏材與之的親緣關系都非常遠，是否是個更古老的野生種，有待進一步確認。而各類君遷子之間的親緣關系較近，聚在一起后與浙江柿相聚，說明浙江柿是與君遷子親緣關系最近的一個近緣種。

3 小結與討論

為檢測在柿栽培種中開發的EST-SSR引物對其近緣種的通用性高低，我們利用11對EST-SSR引物，以20份柿近緣種為試材進行了測試。結果這11對引物均能擴增出產物，且多態性引物比例為100%，表明柿EST-SSR引物對其近緣種是可通用的，而且顯示的多態性頻率很高。EST-SSR標記引物是根據其側翼序列設計的，因此側翼序列的保守程度決定著EST-SSR引物在不同種間的通用性。試驗中，不同EST-SSR引物的通用性不同，引物1430、5845與5553在所有20份柿近緣種材料中都能成功擴增，而引物1554、6615、8917在4個近緣種中無目的擴增產物，這很可能就是它們各自對應EST-SSR的側翼序列的保守程度不同所造成的。

20份柿近緣種的UPGMA聚類分析結果表明，供試的EST-SSR標記在種間進行遺傳分析是比較可靠的。比如各類君遷子屬于同一個種，它們能夠很好地聚在一起，并且與浙江柿親緣關系較近，此結果與前人研究的一致[13]。

與基因組SSR標記相比，由于EST-SSR來源于基因組編碼序列，其保守程度更高，因此比基因組SSR具有更高的種間通用性[2，14，15]。目前，高通量測序技術可以產生海量的EST序列，這為大量開發EST-SSR標記提供了充足的序列來源。試驗前期分別利用公共數據庫及自主轉錄組測序獲得的柿EST序列開發了100余個EST-SSR標記，根據本試驗的結果，柿EST-SSR標記具有很高的種間通用性，這就有效地彌補了柿近緣種分子標記的不足，提高了該標記的利用價值，為柿近緣種的種質鑒定及遺傳分析等研究工作提供了標記資源。

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（責任編輯 王 珞）

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