骨肉瘤常用化療藥物作用的分子機制及用藥方法選擇

徐袁秋 劉思源 張衛華 劉星 林亮 許新明

骨肉瘤是最常見的原發于骨組織的惡性腫瘤，好發于青少年，易發生早期肺轉移，預后較差，是嚴重危害青少年健康的惡性腫瘤之一。對化療有一定的敏感性。目前對骨肉瘤患者多采用以吡柔比星、順鉑、甲氨蝶呤和異環磷酰胺等綜合化療方法。關于具體的用藥方法和作用機制并未作深入的研究。本實驗旨在對吡柔比星、順鉑、卡鉑、甲氨蝶呤、異環磷酰胺等藥物對骨肉瘤細胞株(MG-63)的細胞毒性及分子作用機制，為臨床應用提供實驗依據的同時指導臨床用藥。

1 材料與方法

1.1 材料 人成骨肉瘤細胞株(MG-63)取自河北醫科大學第三醫院綜合實驗中心;吡柔比星為深圳萬樂藥業有限公司產品;順鉑(批號:8090162DB)、卡鉑(批號:8110172ES)為齊魯制藥有限公司產品;甲氨喋呤(批號:08082511)、異環磷酰胺(批號:08062811)為江蘇恒瑞醫藥有限公司產品;無支原體胎牛血清為杭州四季青生物制品廠產品;使用的其他材料包括 MTT、DMEM培養基、二甲基亞砜、EDTA、胰蛋白酶、細胞培養瓶、48孔培養板、0.22 μm微孔慮膜及加樣器。

1.2 方法

1.2.1 在 37℃、5%CO2、95% 空氣、飽和濕度下 CO2孵箱內閉式傳代培養細胞，將傳代后第3天處于指數增殖期細胞經EDTA和胰酶消化制成懸液后分別接種到3個48孔板上，每孔加90 μl的細胞懸液(細胞濃度為1.5×104/ml)和10 μl的藥物。加入不同濃度的藥物，培養的時間分別為24、48、72 h。利用倒置顯微鏡觀察細胞的形態。

1.2.2 經上述處理，分別在 24、48、72 h 后加 MTT 10 μl/孔，繼續培養4 h，在平板離心機上離心10 min，2 000 r/min，棄上清液，加二甲亞砜 150 μl/孔，待結晶溶解后，用全自動酶標儀(波長690 nm)測定每一孔的吸光度 A值(OD值)，并計算其細胞毒性指數值(CI)，CI=(對照組A值－試驗組A值)/對照組A值×100%。利用MTT法制作藥物濃度時間曲線。

1.2.3 利用流式細胞儀進行細胞周期的分析。將濃度為0.4×106/ml的細胞懸液12 ml和不同濃度的吡柔比星、順鉑、卡鉑、甲氨蝶呤、異環磷酰胺共同置于75 cm2的培養瓶分別培養24、48和72 h后將培養液連同用EDTA和胰蛋白酶消化下的骨肉瘤細胞一起離心、清洗，經染色后行細胞周期分析，了解細胞的周期分布及細胞的增殖活性。

1.2.4 利用免疫印跡法檢測不同基因的變化情況。將濃度為0.4×106/ml的細胞懸液12 ml和不同濃度的吡柔比星、順鉑、卡鉑、甲氨蝶呤共同置于75 cm2的培養瓶培養48 h，收集細胞離心，于－20℃保存。配置凝膠后加樣電泳，并轉膜，分別加入一抗和二抗并進行圖像分析

1.3 統計學分析 應用SPSS 13.0統計軟件，計量資料以±s表示，各組數據比較采用多因變量方差分析，兩兩比較采用t檢驗，P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞在倒置顯微鏡下的形態學變化 倒置顯微鏡下觀察到骨肉瘤細胞(MG-63)與吡柔比星、順鉑、卡鉑、甲氨蝶呤培養基作用24 h后細胞增值數量減少，少量細胞壞死漂浮，48 h后漂浮細胞明顯增多，一部分胞膜破裂細胞壞死，存活細胞顏色晦暗，胞漿內顆粒增多增粗，72 h后部分細胞漂浮，大部分細胞溶解。見圖1。

圖1 不同種類的化療藥不同時間對MG-63的抑制情況(HE×20)

2.2 MTT實驗 不同濃度吡柔比星、順鉑、卡鉑、甲氨蝶呤對MG-63細胞分別作用24、48和72 h后，對細胞的生長均起到抑制作用。不同時間組及不同濃度組與對照組相比，順鉑和卡鉑對MG-63細胞的生長抑制作用差異均有統計學意義(P＜0.05)，且隨著藥物濃度的增加及作用時間的延長抑制率也隨之增加，呈劑量-時間效應關系。根據生長曲線顯示對骨肉瘤細胞株卡鉑的濃度約需25倍于順鉑才能產生相似的生長抑制效應。見圖2。

圖2 不同種類的化療藥不同時間對MG-63的抑制生長曲線

2.3 細胞周期分析顯示 不同濃度吡柔比星、順鉑、卡鉑作用骨肉瘤細胞24、48和72 h后收集細胞流式細胞儀分析結果顯示與對照組相比，在細胞各期均有不同的凋亡峰，細胞周期各期所占比例無明顯變化，抑制作用呈劑量依賴性。見圖3。

2.4 免疫印跡結果顯示 PCNA在與吡柔比星、順鉑、卡鉑、甲氨蝶呤作用的骨肉瘤細胞株表達與對照組相比較明顯下降，Bax表達較對照組明顯增加，Bcl-2表達略減少。cyclin D1、cyclin E的表達明顯減少。見圖4。

3 討論

圖3 不同種類的化療藥不同時間對MG-63細胞株的抑制的流式分析

圖4 不同種類的化療藥不同時間對MG-63細胞株的蛋白免疫沉淀分析

骨肉瘤是兒童和青少年常見的骨惡性腫瘤，盡管早期手術和輔助化療使得患者預后有明顯的改善，但目前仍有28.4%的患者死于遠處轉移［1］。對于遠處轉移的患者，化療是惟一有效的治療方法，新輔助化療對提高骨肉瘤患者的5年生存率至關重要，但應用歷史相對其他惡性腫瘤較短，化療藥物種類不多，探索合理化療方案成為當前關鍵性問題。吡柔比星是阿霉素的衍生物，治療骨肉瘤作用強于阿霉素，而心臟毒性明顯小于阿霉素，因而近年來被廣泛應用于臨床，但它對骨肉瘤細胞影響的機制目前尚無定論。本實驗MTT和FMC結果顯示隨時間延長不同濃度吡柔比星對細胞的最終抑制作用是一致的。凋亡峰最高時的濃度可能是最適濃度，凋亡峰最高的時間和濃度效果最佳。

增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)合成并存在于細胞核內，是一種細胞周期調節蛋白，常作為測定細胞增殖水平的指標，其在細胞核內陽性表達的高低與細胞增殖活性密切相關。測定化療前后腫瘤細胞PCNA的表達，可以對化療效果作出評價。Nakashima等［2］用免疫組化的方法檢測26例骨肉瘤標本，結果示PCNA的陽性率為80.8%，并指出PCNA能較好地反映骨肉瘤組織的增殖能力，通過檢測PCNA在化療前后骨肉瘤組織中的變化，能預測術前化療的療效。本實驗中經吡柔比星、順鉑、卡鉑和甲氨蝶呤作用后PCNA蛋白表達均受抑制，表明可通過抑制PCNA表達使細胞增殖受限。另外，不同濃度吡柔比星、順鉑、卡鉑和甲氨蝶呤作用骨肉瘤細胞后細胞G0/G1比例呈先下降后上升趨勢，表明對骨肉瘤細胞增殖周期G0/G1期延緩作用。蛋白印記法發現吡柔比星、順鉑、卡鉑和甲氨蝶呤分別作用48 h后與對照組相比較cyclin D1和cyclin E過表達均受抑制。通過對細胞周期的影響達到抑制腫瘤生長的作用。

抗腫瘤藥物對腫瘤細胞的抑制方式有多種，如誘導細胞分化、凋亡，促進細胞壞死等。近幾年腫瘤生物治療的熱點是通過誘導腫瘤細胞發生凋亡而達到治療目的，此種療法稱為腫瘤的凋亡療法［3］，細胞凋亡受許多基因調控，Bcl-2基因是與細胞凋亡關系最為密切的凋亡抑制基因。Bax表達本身并不阻斷凋亡，而是具有對抗Bcl-2蛋白抑制凋亡的作用。本實驗通過蛋白印記法結果顯示吡柔比星、順鉑、卡鉑和甲氨蝶呤分別作用48 h后與對照組相比較Bcl-2表達率降低，Bax表達率升高。

本試驗中PCNA在順鉑組和卡鉑組骨肉瘤表達與對照組相比較明顯下降，表明順鉑和卡鉑對骨肉瘤細胞株抑制增殖作用明顯［4］。而Bax表達較對照組明顯增加，Bcl-2表達略減少，結合倒置顯微鏡下的細胞形態學觀察，說明順鉑、卡鉑與骨肉瘤細胞作用后存在凋亡現象，但是未能形成凋亡峰，這可能與鉑類化合物能夠作用細胞生長各個周期有關［5，6］。通過分析順鉑、卡鉑對骨肉瘤細胞各個生長周期的影響及蛋白分子表達情況，肯定了卡鉑和順鉑對骨肉瘤細胞株相似作用機制和細胞毒性反應，了解了其具體作用機制，為臨床應用提供了實驗依據。

MTX是最早公認的對骨肉瘤化療有效的藥物，對多種腫瘤具有良好的抗腫瘤活性，其作用機制為通過對二氫葉酸還原酶(DNA合成所需的重要酶)競爭性抑制而抑制細胞DNA的合成發揮作用，是骨與軟組織腫瘤化療的首選藥物［7］，單藥有效率通常在20% ～30%，提高劑量可以克服腫瘤的耐藥性，增加組織壞死反應率，但大劑量MTX治療可產生嚴重的甚至致命的毒性反應，如肝功能損害、腎功能衰竭、骨髓抑制、胃腸道反應、皮膚黏膜反應以及因此而引發的繼發性感染、出血等。有關化學藥物作用的確切機制至今尚未完全清楚。隨著生物化學修飾的研究，特別是以此為依據的多制劑聯合療法中，制劑間的修飾作用，用藥劑量，投藥順序等方面的研究和應用，使得腫瘤化療效果明顯提高，多種藥物聯合的意義在于將抑制于不同細胞周期的腫瘤細胞進一步殺滅。未來對骨肉瘤的治療以及預防肺轉移的手段在于多種藥物的聯合應用，目前，我們正在尋找新的對骨肉瘤有效的藥物［8］。

1 Niu XH，Cai YB，Zhang Q，et al.Long-term results of combined therapy for primary osteosarcoma in extremities of 189 cases.Zhonghua Wai Ke Za Zhi，2005，43:1576-1579.

2 Nakashima H，Nishida Y，Sugiura H，et al.Telomerase，p53 and PCNA activity in osteosarcoma.Eur J Surg Oncol，2003，29:564-567.

3 Fulda S，Debatin KM.Targeting apoptosis pathways in cancer therapy.Curr Cancer Drug Targets，2004，4:569-576.

4 Li Y，Bckesj CM，Haldosén LA，et al.Resveratrol inhibits proliferation and promotes apoptosis of osteosarcoma cells.Eur J Pharmacol，2009，609:13-18.

5 Ohe Y，Ohashi Y，Kubota K，et al.Randomized phase III study of cisplatin plus irinotecan versus carboplatin plus paclitaxel，cisplatin plus gemcitabine，and cisplatin plus vinorelbine for advanced non-small-cell lung cancer:Four-Arm Cooperative Study in Japan.Ann Oncol，2007，18:317-323.

6 Martelli L，Di Mario F，Botti P，et al.Accumulation，platinum-DNA adduct formation and cytotoxicity of cisplatin，oxaliplatin and satraplatin in sensitive and resistant human osteosarcoma cell lines，characterized by p53 wild-type status.Biochem Pharmacol，2007，74:20-27.

7 Karasulu HY，Karabulut B，Gker E，et al.Controlled release of methotrexate from w/o microemulsion and its in vitro antitumor activity.Drug Deliv，2007，14:225-233.

8 Liu SY，Song SX，Lin L，et al.Molecular mechanism of cell apoptosis by paclitaxel and pirarubicin in a human osteosarcoma cell line.Chemotherapy，2010，56:101-107.