氣相色譜高分辨質(zhì)譜測定嬰兒胎發(fā)中含氯持久性有機污染物

宋淑玲+胡小健+祁鵬+李松+佟玲+田芹+馬曉東

摘 要 嬰兒的胎發(fā)是評價嬰兒在母體環(huán)境中污染物累積暴露水平的良好介質(zhì)。含氯持久性有機污染物是人體中殘留濃度最高的持久性有機污染物。本研究依次采用HCl酸化、正己烷/二氯甲烷混合溶液萃取、硅膠和氧化鋁混合填充小柱凈化，以及氣相色譜高分辨質(zhì)譜法檢測了北京20個嬰兒胎發(fā)中的16種典型含氯持久性有機污染物。結(jié)果表明，16種目標物的檢出限可達到1.0～2.5 μg/kg，替代物五氯硝基苯回收率大于67.6%，加標樣品中目標物回收率范圍為62.5%～92.3%。20個胎發(fā)樣品中六氯苯、β-六六六和p，p′-滴滴伊檢出率均為100%，γ-六六六、2，4，4′-三氯聯(lián)苯和2，2′，5，5′-四氯聯(lián)苯的檢出率分別為85%， 50%和40%。4種污染物總量的濃度分布范圍分別為5.48～8.40 μg/kg（六氯苯）、3.86～27.1 μg/kg（六六六）、1.16～18.3 μg/kg（滴滴涕）和2.20～22.1 μg/kg（多氯聯(lián)苯），平均濃度分別為6.91，6.10，5.53和3.44 μg/kg。此方法和分析結(jié)果可用于胎兒體內(nèi)16種含氯持續(xù)性有機污染物蓄積水平和母體內(nèi)累計暴露水平的評價。

關(guān)鍵詞 胎發(fā);含氯持久性有機污染物;氣相色譜高分辨質(zhì)譜;累積暴露

1 引 言

大量研究表明，有機氯農(nóng)藥（Organochlorine pesticides， OCPs）和多氯聯(lián)苯（Polychlorodiphenyls， PCBs）是人體內(nèi)蓄積濃度最高、代謝速度極為緩慢的持久性有機污染物（Persistent organic pollutants， POPs）[1]。在懷孕期間，母體中蓄積的高濃度OCPs和PCBs通過各種途徑進入胎兒體內(nèi)及各種脂肪組織或器官。目前，研究者通常采用臍帶血為介質(zhì)[2～5]，通過分析其中的POPs濃度評價胎兒在母體內(nèi)POPs的暴露風險。遺憾的是臍帶血取樣困難，同時臍帶血中POPs的濃度會隨著母體血液中POPs濃度改變^[6]反映的是胎兒的短期暴露水平，不能直接反映胎兒體內(nèi)以及胎兒在母體內(nèi)POPs的蓄積水平。

胎兒在母體中15周后開始生長胎發(fā)，而胎發(fā)具有生長周期長、容易采集和不傷害嬰兒身體的特點。本研究以胎發(fā)為介質(zhì)，分析其中典型的16種含氯高濃度POPs，進而評價嬰兒在母體中的累積暴露水平。

早在1992年，Schramm等就指出頭發(fā)含有3%～4%的脂肪，是評價人體在環(huán)境中有機污染物長期暴露和短期暴露情況的良好生物介質(zhì)^[7，8]。隨后，更多的研究者均驗證了頭發(fā)作為監(jiān)測基質(zhì)，評價人體在環(huán)境中有機污染物的暴露風險的可行性，并開展了相關(guān)的研究[9～13]。如Schummer等以頭發(fā)為介質(zhì)，通過分析當?shù)鼐用耦^發(fā)等多種介質(zhì)中農(nóng)藥，評價了不同農(nóng)藥的暴露水平^[14]; Wielgomas等分析了40年內(nèi)波蘭人發(fā)中的含氯POPs的變化趨勢，表明人發(fā)中含氯POPs濃度持續(xù)下降^[15]，Behrooz等利用人發(fā)研究了伊朗懷孕女性含氯POPs的暴露水平^[16]， Kerstin等采集德國兒童頭發(fā)，研究了兒童體外含氯POPs的暴露水平^[17]。以上結(jié)果均表明，頭發(fā)可作為一種評價人體含氯POPs的暴露水平的良好介質(zhì)。但當前的研究主要以成年人頭發(fā)為介質(zhì)研究暴露水平，鮮有用胎發(fā)作為監(jiān)測介質(zhì)，評價胎兒在母體內(nèi)POPs的暴露水平或出生前體內(nèi)POPs的蓄積水平。其主要原因是胎發(fā)中目標物含量低，且樣品難收集、采樣量有限，故對分析方法的靈敏度和檢出限要求高。

本研究收集了北京地區(qū)20個胎發(fā)樣品， 采用氣相色譜高分辨質(zhì)譜（Gas chromatography and high resolution mass spectrometry， GC-HRMS）準確測定20個胎發(fā)樣品中低含量典型含氯POPs的種類和濃度，初步評價北京嬰幼兒在母體中含氯POPs的暴露水平。

2 實驗部分

2.1 儀器與材料

AutoSpec Premier 型高分辨質(zhì)譜儀，配有Agilient 7890氣相色譜儀和自動進樣器（美國Waters公司）; GC 2010氣相色譜儀（日本Shimadzhu公司），配有電子捕獲檢測器（Electron capture detector， ECD）; LABORATA4003型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國Heidolph公司）; KL512/509J型氮吹儀（中國康林公司）。

硅膠（75～150 μm）和氧化鋁（150 μm）均為分析純（北京化學試劑廠）;酸化硅膠： 將27 mL濃H2SO4與50 g 硅膠充分振蕩、混勻后放入干燥器備用;10%水鈍化氧化鋁： 向100 g中性氧化鋁中加入10 mL超純水，充分振蕩、混勻放入干燥器中備用。

2.2 標準溶液和主要試劑

8種OCPs混合標準溶液：α-六六六（α-Hexachlorocyclohexane，α-HCH）、β-六六六（β-HCH）、 γ-六六六（γ-HCH）、δ-六六六（δ-HCH）、p，p′-滴滴伊（1，1-Dichloro-2-（4-chlorophenyl）-2-（4-chlorophenyl）ethene，p，p′-DDE）、p，p′-滴滴滴（1，1-Dichloro-2-（4-chlorophenyl）-2-（4-chlorophenyl）ethane，p，p′-DDD）、o，p′-滴滴涕（o，p′-DDT）、p，p′-滴滴涕（p，p′-DDT），濃度50 mg/L，甲醇相。六氯苯（Hexachlorobenzene， HCB），濃度為101 mg/L，異辛烷相。7種PCBs混合標準溶液：2，4，4′-三氯聯(lián)苯（2，4，4′-Trichlorobiphenyl，PCB28）、2，2′，5，5′-四氯聯(lián)苯（2，2′，5，5′-Tetrachlorobiphenyl，PCB52）、2，2′，4，5，5′-五氯聯(lián)苯（2，2′，4，5，5′-Pentachlorobiphenyl，PCB101）、2，3′，4，4′，5-五氯聯(lián)苯（2，3′，4，4′，5-Pentachlorobiphenyl，PCB118）、2，2′，3，4，4′，5′-六氯聯(lián)苯（2，2′，3，4，4′，5′-Hexachlorobiphenyl，PCB138）、2，2′，4，4′，5，5′-六氯聯(lián)苯（2，2′，4，4′，5，5′-Hexachlorobiphenyl，PCB153）、2，2′，3，4，4′，5，5′-七氯聯(lián)苯（2，2′，3，4，4′，5，5′-Heptachlorobiphenyl，PCB180），濃度2.0 mg/L，異辛烷相。以上標準均購自中國計量科學研究院國家標準物質(zhì)研究中心。endprint

五氯硝基苯，濃度為10 mg/L，環(huán)己烷相（Dr.Ehrenstorfer公司）;正己烷，二氯甲烷（色譜純，百靈威科技有限公司）;HCl（優(yōu)級純，北京化學試劑廠）。

2.3 樣品處理方法

嬰兒出生30天內(nèi)采集胎發(fā)，并收集到密封袋中。將胎發(fā)用去離子水清洗后，自然晾干，并剪成1～3 mm。準確稱取100 mg胎發(fā)，轉(zhuǎn)移到15 mL的離心管中，加入20 μL 1.0 mg/L 五氯硝基苯，6 mL 4 mol/L HCl，加蓋，置60 ℃水浴中連續(xù)酸化16 h^[12]。

向離心管中加入3 mL 正己烷-二氯甲烷（4∶1， V/V）進行液液萃取，充分振搖5 min，收集上層的提取液，并用等體積的正己烷-二氯甲烷重復(fù)萃取一次。合并兩次萃取液，將萃取液濃縮到2～3 mL，并用硅膠、氧化鋁和無水Na2SO4的混合自制SPE柱凈化樣品，以15 mL正己烷-二氯甲烷（4∶1， V/V）為淋洗液，濃縮洗脫液，并用正己烷定容至1.0 mL，待測。

2.4 氣相色譜-高分辨質(zhì)譜分析方法

GC分析條件：進樣口溫度290 ℃;無分流進樣;載氣（高純氦氣，99.999%）流速1.2 mL/min。色譜柱 DB-5MS（J&W， 60 m×0.25 mm×0.25 μm）。色譜柱升溫程序：初始80 ℃保持2.0 min，以15 ℃/min升溫至150 ℃，再以15 ℃/min升溫至270 ℃保持3 min，最后以15 ℃/min升溫至300 ℃保持1.0 min。傳輸線溫度250 ℃;質(zhì)譜條件：電子轟擊（EI）離子源能量35 eV;溫度280 ℃;檢測方式多離子檢測（MID）;加速電壓8000 V;分辨率用全氟煤油PFK43調(diào)協(xié)分辨率到10000。

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜柱的選擇

弱極性色譜柱通常是分析有機氯農(nóng)藥和多氯聯(lián)苯類化合物的理想色譜柱。研究中比較了多個廠家、不同長度、相似極性的毛細管色譜柱對16種目標物的分離效果。這些色譜柱包括DB-5， HT-8， Rtx-CLPesticides2， VF-5和VF-1701。結(jié)果表明，30 m的色譜柱一般無法實現(xiàn)16種目標物的基線分離。例如，VF-1701（Varian， 30 m×0.25 mm×0.25 μm）無法分離PCB153和o，p′-DDT，以及基線分離PCB138和p，p′-DDD;DB-5（J&W， 30 m×0.25 mm×0.25 μm）和VF-5（Varian， 30 m×0.25 mm×0.25 μm）無法基線分離o，p′-DDT和p，p′-DDD，以及PCB138和p，p′-DDT;Rtx-CLPesticides2無法分離PCB138和p，p′-DDT。而HT-8（SGE， 25 m×0.22 mm×0.25 μm）、DM-5MS（Dikma， 30 m×0.25 mm×0.25 μm）、DM-5MS（Dikma， 50 m×0.25 mm×0.25 μm）和DB-5MS（J&W， 60 m×0.25 mm×0.25 μm）均能有效分離16種目標物，特別是o，p′-DDT和p，p′-DDD、o，p′-DDT和PCB153以及PCB138和p，p′-DDT這3對化合物。圖1例舉了3種色譜柱上16種目標物的GC-ECD色譜分離圖。

3.2 質(zhì)量控制

質(zhì)量控制主要包括試劑空白和分析過程全流程控制。

16種目標物是環(huán)境中普遍存在的典型含氯POPs，其在胎發(fā)中濃度遠低于其它生物樣品中的濃度。為了確保分析結(jié)果的準確度和精密度、降低方法的檢出限，需要最低限度地降低空白本底值和減少干擾。將實驗中使用的正己烷和二氯甲烷分別取50 mL進行濃縮，然后定容到1.0 mL，分別以HT-8（30 m）， DM-5MS（30 m）， DM-5MS（50 m）和DB-5MS（60 m）色譜柱進行分析，并與16種目標物色譜圖對比。結(jié)果表明，正己烷和二氯甲烷中的16種目標物的濃度均低于0.02 μg/L，但HT-8無法基線分離δ-HCH與干擾物鄰苯二甲酸酯;DM-5MS（30 m）無法基線分離PCB180與某大分子干擾物;只有DM-5MS （50 m×0.25 mm×0.25μm）和DB-5MS（60 m×0.25 mm×0.25 μm）能同時滿足所有目標物，以及目標物與空白樣品中干擾物的基線分離。本研究選擇DB-5MS（60 m）作為分析色譜柱。

采用添加替代物、全流程試劑空白和試劑空白加標監(jiān)控分析全流程，并采用平行樣品、實際樣品和實際樣品添加標準（實際加標樣品）評價方法的穩(wěn)定性、準確性和精密度。樣品提取前，每個樣品中添加五氯硝基苯作為替代物，試劑空白加標和實際加標樣品中添加了目標物，并以五氯硝基苯的回收率、試劑空白加標樣品和實際加標樣品中目標物的回收率評價目標物在整個過程中的損失及整個分析方法準確度。結(jié)果表明，五氯硝基苯的回收率范圍為67.6%～85.2%，加標樣品中目標物回收率范圍為62.5%～92.3%。

3.3 分析方法的靈敏度和檢出限

在2001年，Covaci等^[12]采用GC-ECD分析技術(shù)檢測人發(fā)中含氯有機污染物。由于頭發(fā)中目標物濃度低，為了提高分析方法的靈敏度和降低檢出限，該方法在樣品前處理時需將樣品提取液或凈化液濃縮到50 μL后進樣。這樣大大延長了樣品前處理時間，同時容易造成低沸點目標物HCB和HCH的損失，且單獨采用保留時間定性也難以保證定性分析的準確性。本方法采用GC-HRMS技術(shù)，將儀器的檢出限從1.0 μg/L（GC-ECD）降低到0.20～0.50 μg/L，在簡化和縮減了樣品前處理過程和時間的同時，確保了分析的靈敏度和定性與定量分析的準確性。表1中列出了16種目標物的HRGC-HRMS分析方法參數(shù)。endprint

3.4 嬰兒胎發(fā)中16種含氯POPs的殘留情況

所有樣品中均有HCB， HCHs和DDTs檢出，濃度范圍分別為5.48～8.40 μg/kg， 3.86～27.1 μg/kg和1.16～18.3 μg/kg， 表明胎兒在母體中不同污染物的累積暴露水平差異顯著。

胎發(fā)中檢出的HCHs以β-HCH和γ-HCH為主，兩者平均濃度分別為9.27和5.81 μg/kg，檢出率分別為100%和85%。與本研究組前期的母乳中HCHs研究結(jié)果相比^[18]，嬰兒胎發(fā)中γ-HCH與β-HCH濃度差異顯著減小，而檢出率顯著提高。這可能是由于γ-HCH的水溶解性比β-HCH強，更容易通過血液從母體運輸?shù)教后w內(nèi)及胎發(fā)。除了β-HCH和γ-HCH外，α-HCH的檢出率為30%（均值為3.32 μg/kg），δ-HCH未檢出。

嬰兒胎發(fā)中HCB的平均濃度為6.91 μg/kg，與HCHs和PCBs相比，個體間濃度無顯著差異。這可能由于HCB是一種多源性釋放和多形式傳輸?shù)牡湫蚉OPs。

與有機氯農(nóng)藥相比，胎發(fā)樣品中PCBs的檢出率較低，以低氯代PCB28和PCB52為主，檢出率為50%和40%，質(zhì)量濃度占胎發(fā)中16種POPs總量的24%（如圖2）。與HCHs和DDTs相比，PCBs各種單體的檢出濃度差異較大，例如PCB28的濃度范圍為1.70～21.3 μg/kg。這種濃度的顯著差異性，以及與母體中PCBs蓄積水平的相關(guān)性，還有待進一步研究。

4 結(jié) 論

采用HRGC-HRMS方法檢測嬰兒胎發(fā)中16種典型含氯POPs，對16種目標物在多種色譜柱上分離效果進行了比較和篩選，本方法靈敏度高，定性準確，很好地滿足嬰兒胎發(fā)中低含量POPs的檢測要求。研究結(jié)果表明，20個胎發(fā)樣本中普遍檢測出典型含氯有機污染物HCHs， HCB， DDTs和PCBs，其中OCPs和PCBs的平均殘留總量分別為36.3和24.1 μg/kg，OCPs的殘留濃度和比重均大于PCBs。此結(jié)果與其它以臍帶或胎盤血為介質(zhì)評價胎兒在母體內(nèi)含氯POPs暴露風險的研究結(jié)果一致，但胎發(fā)中HCHs和PCBs濃度顯著高于現(xiàn)有報道的臍帶或胎盤血中HCHs或PCBs的濃度^[19，20]。因此，胎發(fā)中POPs的監(jiān)測既可在一定程度上反映胎兒在母體中POPs累積蓄積水平，又能反映胎兒在母體中的POPs暴露風險。

References

1

LIN Zhu-Guang， JIN Zhen， LIU Yong， FAN Yu-Lan， TAN Jun， MA Yu， CHEN Mei-Yu， CHEN Zhao-Bin. Chem. J. Chinese Universities， 2005， ?26（12）： 2218-2222

林竹光， 金 珍， 劉 勇， 范玉蘭， 譚 君， 馬 玉， 陳美瑜， 陳招斌. 高等學校化學學報， 2005， 26（12）： 2218-222

2 HE Sheng-Liang， HAI Guan-Geng， LI Chao-Lin， ?LI Shuang. Chinese J.Prev. Med.， 2006， 7（4）： 334-336

何升良， 韓關(guān)根， 李朝林， 李 霜. 中國預(yù)防醫(yī)學， 2006， 7（4）： 334-336

3 LI Shuang， HAN Guan-Geng， XU Ying， CHEN Ling-Xuan， REN Jun， ZHOU An-Shou， SHI Xiao， LI Zhao-Lin. Chinese J.Ind. Med.， ?2006， 19（3）： 136-138

李 霜， 韓關(guān)根， 徐 盈， 陳令宣， 任 軍， 周安壽， 史 曉， 李朝林. ?中國工業(yè)醫(yī)學， 2006， 19（3）： 136-138

4 Wang Y R， Zhang M， Wang Q， Yang D Y， Li C L， Liu J， Li J G， Li H， Yang X Y. Sci. Total Environ.， ?2008， 396（1）： 34-41

5 Yu Y X， Wang X L， Wang B， Tao S， Liu W X， Wang X J， Cao J， Li B G， Lu X X， Wong M H. Environ. Sci. Technol.， ?2011， 45（23）： 10235-10242

6 Adetona O， Horton K， Sjodin A， Jones R， Hall D B， Manuel A V， Cassidy B E， Vena J E， Needham L L， Naeher L P. Chemosphere， ?2013， 91（10）： 1426-1433

7 Schramm K W， Kuettner T， Weber S， Lutzke K. Chemosphere， ?1992， 24（3）： 351-358

8 Schramm K W. Bull. Environ. Contam. Toxicol.， ?1997， 59（3）： 396-402

9 Covaci A， Tutudaki M， Tsatsakis A， Schepens P. Chemosphere， ?2002， 46（3）： 413-418

10 Salquèbre G， Schummer C， Millet M， Briand O， Appenzeller B M R. Anal. Chim. Acta， ?2012， 710： 65-74endprint

11 Zhao G F， Wang Z J， Dong M H， Rao K F， Luo J P， Wang D H， Zha J M， Huang S B， Xua Y P， Ma M. Sci. Total Environ.， ?2008， 397（1-3）： 46-57

12 Covaci A， Schepens P. Chromatographia， ?2001， 53（1）： S366-S371

13 Ostrea E M Jr.， Bielawski D M， Posecion N C Jr， Corrion M， Esterlita V Uy， Bernardo R C， Jin Y， Janisse J J， Ager J W. Environ. Res.， ?2009， 109（1）： 116-122

14 Schummer C， Salquèbre G， Briand O， Millet M， Appenzeller B M. Toxicol. lett.， ?2012， 210（2）： 203-210

15 Wielgomas B， Czarnowski W， Jansen EH. Chemosphere， ?2012， 89（8）： 975-981

16 Behrooz R D， Barghi M， Bahramifar N， Sari A E. Chemosphere， ?2012， 86（3）： 235-241

17 Kerstin N， Merkel G， Randow F F E. Toxicol. Lett.， ?1999， 107（1）： 189-192

18 Song S L， Ma X D， Tong L， Tian Q， Huang Y， Yin S Q， Sun H B. Environ. Monit. Assess.， ?2013， 185（9）： ?7225-7229

19 Lopes B， Arrebola J P， Serafim A， Company R， J. Olea R N. Chemosphere， ?2014， 114： 291-302

20 Dewan P， Jain V， Gupta P， Banerjee B D. Chemosphere， ?2013， 90（5）： 1704-1710

Determination of Chlorinated Persistent Organic Pollutants in Infant Hair

by Gas Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry

SONG Shu-Ling1， HU Xiao-Jian3， QI Peng1， LI Song1， TONG Ling1， TIAN Qin1， MA Xiao-Dong*2

1（National Research Center for Geological Analysis， Beijing 100037， China）

2（Applied Chemistry， China Agricultural University， Beijing 100193， China）

3（Institute of Environmental Heath and Relative Product Safety China Centers for Disease Control， Beijing 100021， China）

Abstract ?Infant hair is a good medium to assess the cumulative exposure level of infant in the mother's body. Chlorinated persistent organic pollutants were ubiquitous and with the highest volume concentration in the human body. In this experiment， 20 infant hairs were collected from Beijing. The sample was overnight incubated in HCl， extracted with the mixture of hexane and dichloromethane， and cleaned up by a cartridge filled with alumina and acidified silica. The final eluate was concentrated， and 16 kinds of typical chlorinated persistent organic pollutants were detected with gas chromatography-high resolution mass spectrometry （HRGC-MS）. The results showed that the detection limit of the target compounds in sample was 1.00-2.50 μg/kg， the recovery of surrogate in all samples was more than 67.6%， and the range of recoveries for target compounds in spiked sample was 62.5%-92.3%. The positive rate is 100% for hexachlorobenzene， β-HCH and p，p′-DDE， 85% for γ-HCH， 50% for PCB28， and 40% for PCB52. The concentrations of Hexachlorobenzene， HCHs， DDTs and PCBs were 5.48-8.40 μg/kg， 3.86-27.1 μg/kg， 1.16-18.3 μg/kg and 2.20-22.1 μg/kg， respectively. The average concentrations were 7.84 μg/kg for hexachlorobenzene， 6.93 μg/kg for HCHs， 5.53 μg/kg for DDTs， and 3.44 μg/kg for PCBs. The method and the analysis results can be used to evaluate the accumulation level and cumulative exposure level of 16 target compounds for fetal in mother′s body.

Keywords Infant fair; Chlorinated persistent organic pollutants; Gas chromatography-high resolution mass spectrometry; Cumulative exposure

（Received 21 August 2014; accepted 9 October 2012）

This work was supported by the Key Projects in the National Science & Technology Pillar Program （No.2011BAE06B09-04）endprint