全血改進線性指數聚合酶鏈式反應用于焦磷酸測序檢測基因多態性

項錚+劉云龍+邢曉清+初亞男+宋沁馨+周國華

摘 要 焦磷酸測序是目前基因多態性檢測的主要方法之一，但是其前期的樣本制備工作較為繁瑣，限制了其在臨床檢測中的應用。為了簡化焦磷酸測序的流程，本研究根據不對稱PCR原理，改進了線性指數聚合酶鏈式反應（LATE-PCR）的引物設計方法，增加過量引物的長度和濃度，并結合全血直接擴增技術，建立了基于普通rTaq聚合酶和高pH 緩沖液（HpH Buffer）的全血改進LATE-PCR（Improved LATE-PCR， imLATE-PCR）方法?？疾炝朔椒ǖ淖顑灁U增體系、血液抗凝劑對其影響以及全血模板量。采用單管、一步法直接擴增出單鏈測序模板，成功地對24例臨床血樣的乙醇脫氫酶基因多態性進行了檢測，檢測結果可用于指導臨床個體化用藥。24例樣本的基因型分別為ADH1B位點AA純合6例、AG雜合14例、GG純合4例; ADH1C位點GG純合20例、AG雜合4例、AA純合0例。

關鍵詞 全血直接擴增; ?線性指數聚合酶鏈式反應; ?焦磷酸測序; ?基因多態性; ?酒精代謝

1 引 言

隨著基因組學及后基因組學的發展，人們意識到基因多態性在闡明疾病的發生和發展、毒物的易感性與耐受性、疾病臨床表現的多樣性以及對藥物治療的反應上都起著重要作用，而單核苷酸多態性是目前最受關注的一類多態性。

焦磷酸測序技術是通過核苷酸和單鏈模板結合后釋放焦磷酸引發酶級聯反應，促使熒光素發光并進行檢測的一種核酸測序技術[1～3]，用于基因多態性檢測^[4]、微生物分型^[5]、基因甲基化檢測^[6]等領域，尤其是在大規模DNA測序中^[7]的應用，使測序技術發生了革命性變化。但是目前焦測序的單鏈模板制備主要采用固相微球法^[8]，該方法操作步驟繁瑣且效率較低; 使用生物素標記引物、鏈親和素包被微球增加了檢測的成本; 同時，單鏈制備過程中容易引起樣品的交叉污染，以上不足極大地妨礙了焦測序技術的臨床應用^[9]。

為了解決單鏈模板制備問題，可以采取不對稱PCR直接產生單鏈產物^[10]，但常規不對稱PCR方法擴增單鏈的效率低，無法得到廣泛使用。線性指數PCR（Linear-after-the exponential-polymerase chain Rreaction， LATE-PCR）^[11]在不對稱PCR的基礎上，通過優化引物濃度和Tm值，可獲得接近對稱PCR的擴增效率，產生大量單鏈DNA產物，能夠滿足基于單鏈核酸序列的雜交、實時熒光PCR等反應的需要^[12]。但是LATE-PCR引物設計要求嚴格，且隨著PCR的進行，非限制性引物與擴增產物產生競爭，若擴增片段較長則得到的單鏈DNA產率會降低。改進的LATE-PCR方法（Improved LATE-PCR， imLATE-PCR）^[13]彌補了LATE-PCR的不足，增加非限制性引物長度，減少限制性引物長度，使兩者的Tm差值更大，引物的設計相較于LATE-PCR更為寬泛，產生擴增片段長度也更長，擴大了不對稱PCR的實際使用范圍。

為了提高基因檢測速度，降低樣本污染的可能性，本研究將全血直接擴增和imLATE-PCR技術相結合，建立了基于普通rTaq聚合酶和“高pH緩沖液（HpH Buffer）”的全血imLATE-PCR擴增方法。本方法具有以下優點：（1）檢測速度快，操作簡便。采用全血直接作為擴增單鏈DNA測序的模板，省去了DNA提取和單鏈模板制備兩個繁瑣的步驟，極大提高了檢測速度，簡化了操作過程，縮短了檢測時間; （2）成本低，經濟環保。無需制備DNA單鏈可以避免使用生物素修飾引物和磁性微球，無需DNA提取可以省去大量有機試劑和實驗耗材，降低了成本; （3）污染少。避免了DNA提取和模板制備過程中反復打開管蓋進行加液、移液等操作，減少了平行測多份樣品時交叉污染的可能性; （4）靈敏度高。實驗表明， 0.1 μL全血即采用指尖取血即可得到較好的測序結果，應用于臨床檢測方便、快速^[14]。采用本方法對酒精代謝相關基因ADH1B、ADH1C進行了基因多態性焦測序檢測，用于臨床快速評估人體酒精代謝能力，對于預防與飲酒行為相關的多種疾病，以及常規體檢監測有重要意義。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

EDC-10基因擴增儀（東勝創新生物科技有限公司）; 小型焦測序儀（日本Hitachi公司）。

三磷酸腺苷硫酸化酶（ATP-sulfurylase）和Klenow聚合酶為實驗室自表達; rTaq DNA聚合酶、500 bp DNA Ladder marker（日本Takara公司）; 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、QuantiLum重組熒光素酶（美國Promega公司）; 腺苷三磷酸雙磷酶-Ⅶ（Apyrase-Ⅶ）、腺苷-5′-磷酸硫酸（Adenosine 5′-phosphosulfate， APS）、牛血清蛋白（Bovine serum albumin， BSA）（美國Sigma公司）; Sepharose Beads（美國GE Healthcare公司）; α-硫化三磷酸腺苷 （dATPαS）、三磷酸脫氧胞苷酸（dCTP）、三磷酸脫氧鳥苷酸（dGTP）、三磷酸脫氧胸腺苷酸（dTTP）（美國Amersham Pharmacia公司）; 其它試劑均為分析純; 實驗用水均為滅菌二次蒸餾水。endprint

所有引物由上海Invitrogen公司合成，具體引物名稱及序列見表1。

2.2 實驗方法

2.2.1 imLATE-PCR引物設計 本研究選取與酒精代謝相關的乙醇脫氫酶（ADH）基因中中國人較常見位點進行擴增。擴增引物使用Primer 5.0軟件進行設計，引物設計原則：TmE-TmL≥5 ℃; TmA-TmE≤13 ℃^[13]（TmE為過量引物Tm值，TmL為限制性引物Tm值，TmA為擴增產物Tm值）。Tm值計算采用OligoAnalyzer 3.1軟件（地址：http：//www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/）。本實驗中所用到的PCR擴增引物見表1。

2.2.2 全血imLATE-PCR擴增 取抗凝外周全血樣本1μL（本研究中血樣均來源于南京軍區總院受試者，受試者已簽署知情同意書并獲得倫理委員會同意。除特別說明，抗凝血所用抗凝劑均為EDTA二鉀。）直接用于ADH1B、ADH1C位點的目的片段擴增。PCR 反應體系包括用于全血PCR 反應的HpH Buffer（100 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L KCl，pH 9.3～9.5）5.35 μL，2 mmol/L Mg2+，dNTPs 100 μmol/L，過量引物（PE）1 μmol/L，限制性引物（PL）0.1 μmol/L，Taq 酶2.5 U，適當PCR添加劑（10% BSA和5% 吐溫20），全血模板1 μL，加水補充至50 μL。ADH1B位點PCR反應條件：3個循環（94 ℃， 3 min; 55 ℃， 3 min）; ? 65個循環（90 ?℃， 10 s; 53 ?℃， 20 s; 72 ?℃， 20 s）。ADH1C位點PCR反應條件： 94 ?℃預變性3 min; ?65個循環（90 ?℃，10 s; 55 ?℃， 20 s; 72 ℃， 20 s）。

2.2.3 單鏈擴增產物處理以及焦磷酸測序 imLATE-PCR擴增產物除了大量單鏈DNA可用做測序模板，還含有過量的dNTPs、延伸產生的PPi、部分未完全延伸的產物等，這些成分都會對后續的焦測序反應造成影響。因此，擴增產物需經過處理后方可進行焦測序反應。本研究使用自制的焦測序反應液^[15]對產物進行處理，主要成分為0.1 mol/L Tris-HAc（pH 7.7），2 mmol/L EDTA，10 mmol/L Mg（Ac）2， 0.1% BSA，1 mmol/L DTT，80 μmol/L APS，0.4 mmol/L D-蟲螢光素，60 U/mL ATP-sulfurylase，1.6 U/mL Apyrase-Ⅶ，18 U/mL Klenow聚合酶，適量熒光素酶。反應液中的APS可以和延伸產生的PPi作用生成ATP，過量的dNTPs和少量的ATP可以在Aprase-Ⅶ作用下發生降解，從而減少對焦測序反應的影響^[10]。具體步驟為：取3 μL imLATE-PCR擴增產物，加入自制焦測序反應液，置于小型焦磷酸測序儀中，室溫反應5 min; 加入10 pmol測序引物，常溫下退火5 min，再循環加入dATPαS， dCTP， dTTP 和dGTP 進行焦測序反應。測序引物如下： ADH1B： 5′-ATGGTGGCTGTAGGAATCTGTC-3′， ADH1C： 5′-TTTCGTTTGAAGTCATCGGTC-3′。

3 結果與討論

3.1 PCR擴增體系對全血imLATE-PCR的影響

以全血代替DNA作為模板，其中的免疫球蛋白G、血紅蛋白和乳鐵蛋白等成分會抑制PCR反應，且常用血液抗凝劑EDTA或肝素也會抑制PCR反應。所以，采用全血代替DNA作為PCR反應模板時，需要調整PCR反應體系。本實驗室之前報道的“HpH Buffer”體系可以很大程度上減少全血成分對PCR擴增的影響，主要由于高pH值的緩沖體系可以使蛋白質表面帶負電，抑制其與帶負電的基因組DNA相互作用，從而降低對PCR反應的抑制作用^[16]。

3.2 全血imLATE-PCR擴增血液模板量考察

考察了上述方法在進行全血imLATE-PCR擴增時，0.05， 0.10， 0.50， 1.00和2.00 μL 5個模板加入量對擴增和測序結果的影響。結果表明，50 μL擴增體系中加入0.10～2.00 μL的EDTA抗凝全血作為模板進行擴增，擴增產物經處理后進行焦測序，均可得到良好的焦測序結果（圖2），擴增產物的檢測平均單堿基信號值分別為0.629、0.794、0.879、0.883，均可進行準確的SNP分型。由此證明，本方法僅需0.10 μL全血樣本就可對乙醇脫氫酶的兩個SNP位點進行焦測序檢測并分型，大大減少了對病人的創傷。

3.3 乙醇脫氫酶ADH1B、ADH1C基因SNP位點檢測

對收集到的24例臨床血樣的乙醇脫氫酶基因ADH1B、ADH1C的多態性檢測結果（圖3）顯示，本方法測序結果較好，測序信號強度高，可以進行準確的SNP分型。24例樣本的基因型測序結果如表2所示，其中ADH1C位點AA純合型本實驗中未檢測到，而NCBI數據庫也顯示了亞洲人群中AA型基因頻率接近于0。為了驗證測序結果的準確性，從24例樣本中抽取10例進行Sanger測序（圖4），結果與本實驗的測序結果完全一致，證明了本方法的準確性。ADH1B位點的AA型和ADH1C位點的GG型的患者酒精代謝能力較強，可加快乙醇向乙醛轉化的速度，易產生面紅、惡心等反應，使飲酒者對乙醇耐受性降低，一定程度上可以避免產生酗酒或酒精依賴^[17]; ADH1B位點的GG純合型和ADH1C位點的endprint

AA型患者的乙醇代謝能力較弱，易產生酒精依賴和酒精濫用，臨床應建議減少酒精的攝入^[18]。

考察了臨床上常用的3種血液抗凝劑EDTA二鉀、檸檬酸鈉和肝素鈉對全血imLATE-PCR擴增的影響。結果表明，3種抗凝劑對擴增無明顯影響，均能夠得到準確的測序結果。

3.4 本方法與傳統焦測序檢測方法的比較

表3是本實驗方法和傳統焦磷酸測序檢測方法^{[20，21]}在耗時和成本方面的比較。本方法以全血作為模板省去了DNA提取過程，從收到樣本到得到PCR擴增產物可在2 h內完成，同時降低了樣品間交叉污染的可能性; 另外，高靈敏的焦磷酸測序在保證檢測準確性的前提下僅使用0.10 μL全血或3.00 μL PCR產物，與傳統焦磷酸測序方法相比，成本下降了約40%。

a基因組DNA提取使用QIAamp DNA 血液提取試劑盒。b傳統PCR方法和全血imLATE-PCR方法均使用rTaq DNA 聚合酶。c傳統基于PCR的焦測序方法單鏈DNA制備使用鏈親和素瓊脂糖球珠。d傳統基于PCR的焦測序方法采用PyroMark Gold Q24 焦測序試劑。

a QIAamp DNA Blood Mini Kit （QIAGEN） was used for gDNA extraction. b rTaq DNA polymerase （TaKaRa） was used for conventional PCR and whole blood-imLATE-PCR. c Streptavidin Sepharose beads （GE Healthcare） were used for ssDNA preparation in conventional PCR-based pyrosequencing. d PyroMark Gold Q24 Reagents （QIAGEN） were used for conventional PCR-based pyrosequencing.

4 結 論

乙醇脫氫酶基因多態性導致乙醇在不同個體中的代謝速率不同。研究表明，急性酒精中毒、酒精性肝病、胰腺炎、心腦血管疾病、肝癌以及結直腸癌等一些癌癥都與乙醇脫氫酶基因多態性有關^[17，18]。乙醇對許多腫瘤是一種促癌劑，已有報道表明乙醇代謝酶基因多態性與腫瘤發生密切相關^[19]。所以檢測酒精代謝相關基因的多態性，評估人體酒精代謝能力，可用于預防與飲酒相關疾病，對人類健康有著非常重要的意義。

本研究改進了LATE-PCR方法，采用“HpH Buffer”以全血為模板直接擴增，建立了全血imLATE-PCR方法，該方法具有檢測速度快、靈敏度高、污染少、成本較低等優點，為臨床上檢測基因多態性和疾病早期預警提供了新手段。

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Genotyping of Alcohol Dehydrogenase Gene by Pyrosequencing

Coupled with Improved Linear-after-the-Exponential

Polymerase Chain Reaction Using Human

Whole Blood as Starting Material

XIANG Zheng1， LIU Yun-Long2， XING Xiao-Qing1， CHU Ya-Nan2， SONG Qin-Xin*1，2， ZHOU Guo-Hua1，2

1（Key Laboratory of Drug Quality Control and Pharmacovigilance of Ministry of Education，

China Pharmaceutical University， Nanjing 210009， China）

2（Department of Pharmacology， Jinling Hospital， Nanjing University School of Medicine， Nanjing 210002， China）

Abstract Pyrosequencing is one of the important genetic polymorphism detection methods currently， but the complicated pretreatment procedure limits its application in clinical test. To simplify the whole process of pyrosequencing， on the basis of the linear-after-the-exponential-polymerase chain reaction （LATE-PCR）， we improved the primer design method of LATE-PCR， increased the length and the concentration of the excess primer， applied direct amplification technology with whole blood， and established a whole blood-imLATE-PCR method based on common rTaq polymerase and “HpH Buffer” （High pH buffer）. The amplification system was optimized， and the influences of blood anticoagulant and the amount of whole blood template were investigated. The single stranded template for the pyrosequencing was obtained by PCR amplification using a single tube in one-step process， and the alcohol dehydrogenase gene polymorphisms of 24 clinical blood samples were then detected successfully. The results could be used to guide clinical individualized medication. The genotypes of ADH1B locus of 24 samples were 6 cases of AA homozygote， 14 cases of AG heterozygote， and 4 cases of GG homozygote. The genotypes of ADH1C were 20 cases of GG homozygote， 4 cases of AG heterozygote， and no cases of AA homozygote.

Keywords Whole blood-polymerase chain reaction; Linear-after-the-exponential-polymerase chain reaction; Pyrosequencing; Gene polymorphism; Ethanolic metabolism

（Received 6 May 2014; accepted 9 September 2014）endprint