基質輔助激光解析電離質譜和電噴霧質譜共同快速確證達托霉素結構

黃亞娟+張拓+韓治國+孟曉光+宋純艷+劉曙晨+鄭俊杰+魏開華

摘 要 運用基質輔助激光解析電離-飛行時間串聯質譜（MALDI-TOF/TOF MS）和電噴霧-四級桿-飛行時間質譜（ESI-Q-TOF MS）快速確證環脂肽達托霉素的結構。首先，ESI檢測達托霉素相對分子量為1619.7107，與理論值偏差0.0007。選擇其雙電荷峰m/z 809.848作為母離子進行ESI串聯質譜（MS/MS）測定，成功匹配了達托霉素環外氨基酸序列C9H19CO-Trp-Asn-Asp。其次，優化LiOH裂解達托霉素的實驗條件，以MALDI-TOF/TOF MS監測開環效果，獲得95%以上的開環樣本后， 分別運用MALDI和ESI進行MS/MS測定，達托霉素開環產物的b+和y+全部被匹配，達托霉素全部氨基酸序列得到確證。最后，對開環產物的ESI-MS/MS條件進一步優化，獲得了豐富的低端碎片離子，解析了脂肪酸鏈結構，并繪制了脂肪酸鏈的裂解圖。本方法快速、簡便、準確，是確證環脂肽類化合物結構的可靠方法。

關鍵詞 達托霉素; 環脂肽; 串聯質譜; 電噴霧質譜

1 引 言

達托霉素（Daptomycin）是從玫瑰孢鏈霉菌（Streptomyces roseosporus）發酵液中提取的一種新型環脂肽類抗生素，能迅速殺死絕大部分革蘭氏陽性菌，并且在體外對已呈現甲氧西林、萬古霉素和利奈唑烷等耐藥性質的分離菌株具有強活性^[1]。達托霉素分子式為C72H101N17O26，含1個親水核及1個親脂尾^[2]，它具有新穎的化學結構：4位蘇氨酸（Threonine ，Thr）的羥基與末尾13位犬尿氨酸（Kynurenine，Kyn）的羧基生成酯鍵，形成含10個氨基酸的環肽;1位色氨酸（Tryptophan ，Trp）的N 末端與十碳脂肪酸形成酰胺鍵，封閉了肽段的N端^[3];分子中包括3個非蛋白源的特殊氨基酸：鳥氨酸（Ornithine， Orn）， 3-甲基谷氨酸（3-Glutamic acid，3-mGlu）和Kyn ^[4]。化學結構見圖1。

達托霉素的結構確證難點是需同時確證環肽的氨基酸序列和環上的脂肪酸鏈結構，尤其還包含多個非天然氨基酸。目前，國內對達托霉素的研究報道多集中在提取、分離、合成和抗菌活性上[5～7]，未見對其結構鑒定。雖然，對其結構鑒定已有文獻報道^[8]，但是多采用核磁共振法，而核磁共振法具有樣品用量大、解譜復雜、分析時間長等缺點。近年來質譜技術得到了廣泛的應用和發展，基于軟電離技術的ESI質譜和基質輔助激光解析電離質譜（MALDI-MS）是兩種最常用的生物質譜，是蛋白質和多肽結構確證的重要手段[9，10]。 本研究利用MALDI和ESI質譜成功地對達托霉素進行了一級結構確認，方法簡便、快速，可為環脂肽類抗生素藥物結構分析提供參考。

2 實驗部分

2.1 儀器與材料

基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀（MALDI-TOF/TOF），micrOTOF-QTMⅡ質譜儀（Bruker公司）; 注射泵（Harvard公司）; C18-ZipTip脫鹽柱（Millipore公司）。 α-氰基-4-羥基肉桂酸（α-CHCA，Fluka公司）; 乙腈（ACN，Fisher公司）; 三氟乙酸（TFA）和甲酸（FA）（Sigma公司）; ?LiOH（國藥集團化學試劑有限公司）; 達托霉素（華北制藥股份有限公司）; Milli-Q超純水。

2.2 實驗方法

2.2.1 樣品直接ESI-MS/MS測定 稱取樣品干粉適量配成0.01 mol/L 的樣品溶液，取樣品溶液15μL，經ZipTip柱脫鹽后， 用0.1% FA溶液稀釋到0.01 g/L，用100 μL直噴進樣。

2.2.2 樣品開環及MS/MS檢測 取0.01 mol/L樣品溶液10 μL， 加入90 μL 0.025 mol/L LiOH溶液，混勻，分別在20和25 ℃下反應0.5， 1， 1.5， 2和3 h。取各反應溶液0.5 μL 點靶，室溫風干后覆蓋α-CHCA基質（5 g/L， 含0.1%TFA的50%ACN溶液），MALDI-TOF/TOF檢測。對最佳開環條件下的樣品反應液經ZipTip柱脫鹽后， 用0.1% FA溶液稀釋至0.01 g/L，取100 μL ESI直噴進樣。

2.2.3 儀器參數 （1）MALDI-TOF/TOF MS儀： 加速電壓18.2 kV;離子源電壓20 kV;N2 激光，波長337 nm，能量3500，PII標準品校正至誤差在0.1 Da以內，串聯質譜檢測能量4000，PII標準品離子峰m/z 1046.540校正至誤差0.05 Da以內。 （2）ESI-MS/MS直噴進樣儀：源溫180 ℃，采集范圍： m/z 50～ 2500，掃描速度： 0.5 s/次，串聯質譜碰撞能量： 20～50 eV。數據分析軟件為Data Analysis 4.1（Bruker）。

3 結果與討論

3.1 達托霉素環外氨基酸序列的確定

ESI測定達托霉素的相對分子量為1619.7107，與其元素組成C72H101N17O26計算所得的理論單同位素相對分子量1619.7100的偏差為0.0007，樣品實測分子量與理論分子量一致。

選擇達托霉素雙電荷峰m/z 809.848作為母離子進行ESI-MS/MS測序，質譜圖見圖2。

達托霉素含3個非蛋白源的特殊氨基酸，根據圖1確定特殊氨基酸殘基的元素組成后， 計算其單同位素相對分子量，計算得出Orn， 3-mGlu和Kyn殘基的單同位素相對分子量分別為114.0794， 143.0615和190.0742。另外，1位的Trp經脂肪酸鏈“C9H19CO”修飾，其殘基相對分子量由C9H19CO和Trp殘基兩部分組成，值為341.2228。由于達托霉素含有環肽，軟件無法解析碎片。 人工解析的結果表明，達托霉素y10， y11， y12， b1， b2離子均被匹配，并且還匹配到a1離子、Trp殘基、達托霉素、y12離子及達托霉素的失水峰，確定出達托霉素環外氨基酸序列為C9H19CO-Trp-Asn-Asp。endprint

3.2 開環達托霉素氨基酸序列的確定

直接ESI-MS/MS未成功解析達托霉素環內氨基酸序列，因此對其開環裂解。達托霉素環肽上的酯鍵可通過LiOH溶液溫和地水解，形成線性肽，相對分子量相應地增加18.0106。MALDI-TOF/TOF-MS耐鹽能力強、分析速度快、圖譜簡單、適合通量分析，利用其監測達托霉素開環程度十分有益。控制達托霉素的終濃度為0.001 mol/L，LiOH的終濃度為0.02 mol/L，在20和25 ℃下反應不同時間，以開環產物與未開環樣品的峰高之比評價開環效果。結果表明， 25 ℃反應1.5 h開環最完全，開環產物峰高約為未開環樣品峰高的10倍，超過95%的達托霉素已開環。此條件與文獻[11]基本一致。

選擇開環產物的雙電荷峰m/z 819.854進行ESI-MS/MS測序，質譜峰去卷積化后運用Biotools Version3.2軟件進行碎片離子歸屬， 肽段序列結果如圖4所示。由于Orn， 3-mGlu， Kyn及N-端被脂肪酸封閉的Trp在Biotools Version3.2中不存在，因此，將這4個氨基酸殘基用軟件中相似的常見氨基酸殘基進行自定義修飾演變。Orn演變為Lys去掉CH2，殘基質量為128.0950-14.01564，在序列中標記為K*;3-mGlu演變為Glu加上CH2，殘基質量為129.0459+14.01564，標記為E*，Kyn演變為Phe加上CONH，其殘基質量為147.0684 + 43.0058，標記為F*;N-端被脂肪酸封閉的Trp演變為Trp加上C10H19O， 殘基質量為186.07931 + 155.1435，標記為W*。測序結果表明，b、y離子均連續匹配，所有匹配離子的誤差均小于0.04 Da（表1），所測環內外氨基酸序列結果與達托霉素理論序列一致。兩種質譜檢測結果相互驗證，達托霉素氨基酸序列正確，開環后序列為 W*-N-D-T-G-K*-D-A-D-G-S-E*-F*，即：

3.3 達托霉素脂肪酸鏈結構確定

上述兩種串聯質譜均檢測到b1離子，其由Trp殘基和脂肪酸鏈C9H19-CO兩部分組成。對于飽和十碳脂肪酸鏈C9H19-CO的結構確認重點是看其是否含有支鏈并確定支鏈的類型及位置，這需從串聯質譜的低質量端離子碎片數據解析。為獲得豐富的低端（m/z 341以下）碎片信息，優化了干燥氣體的流速、氣體溫度、離子源溫度及碰撞能量等質譜參數。結果表明，對質譜信號影響最大的是碰撞能量，與文獻[12]報道一致。在碰撞能量為40 eV的條件下，質譜信號較好，碎片較多，檢測結果見圖5A。檢測到脂肪酸結構相關的碎片離子有m/z 326.20， 284.15， 270.14， 256.12， 230.11， 170.15及155.14，其中離子強度最大的為230.11。

將b1離子看作C9H19-CO-的酰胺類衍生物，文獻[13，14]報道稱脂肪酸的酰胺類衍生物質譜裂解規律同脂肪酸甲酯類有機物一致，而現有文獻對脂肪酸甲酯類有機物的質譜裂解規律較多，可類推到本研究達托霉素b1離子。直鏈飽和脂肪酸甲酯通過γ氫遷移和Mclafferty重排，生成的碎片離子[CH3-O-C（OH）= CH2]+ （m/z 74）為其基峰離子^[15，16]。將甲酯基“-O-CH3”換成Trp殘基，碎片離子的理論m/z為 230.1，實測值中m/z 230.11是脂肪酸鏈結構相關的強度最大的碎片離子，可判斷出達托霉素C9H19-CO為直鏈型。文獻[16]還報道，若飽和脂肪酸含有支鏈，則在支鏈處易發生斷裂。若甲基為支鏈，則會產生兩個較強的碎片離子，其相差[-CH（CH3）-]（m/z 28） 。實測值m/z 284.15與256.12相差28.03，然而這兩峰的峰強較低，尤其m/z 256.12峰強低于m/z 270.14 和170.15，這說明m/z 284.15與 256.12兩碎片離子相差的是[-CH2CH2-]，沒有支鏈。根據以上結果，推斷出達托霉素

b1離子的斷裂模式（圖5B），直觀表達了托霉素脂肪酸鏈的質譜斷裂規律。

本研究采用兩種生物質譜MADI-TOF/TOF和ESI-Q-TOF，從分子量、氨基酸序列及脂肪酸鏈結構的角度對達托霉素進行了快速結構確證，實現了對含有非蛋白源的環肽氨基酸序列和脂肪酸鏈結構的同時解析，對于環脂肽類抗生素藥物結構分析具有參考意義。

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Fast Structure Confirmation of Daptomycin by Matrix-assisted

Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry and

Electrospray Ionization Mass Spectrometry

HUANG Ya-Juan1，2， ZHANG Tuo1，2， HAN Zhi-Guo1，2， MENG Xiao-Guang1，2，

SONG Chun-Yan1，2， LIU Shu-Chen3， ZHENG Jun-Jie*1，2，3， WEI Kai-Hua*1，2，3

1（Beijing C&N International Sci-tech Co.， Ltd， Beijing 102206， China）

2（Beijing Proteome Research Center， State of Key Laboratory of Proteomics，

National Center for Protein Sciences （Beijing）， Beijing 102206， China）

3（Beijing Institute of Radiation Medicine， Military Medical Science Academy ofendprint

China People′s Liberation Army， Beijing 100850， China）

Abstract Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight tandem mass spectrometry （MALDI-TOF/TOF MS） and electrospray ionization-quadrupole-time of flight mass spectrometry （ESI-Q-TOF MS） were used to confirm the structure of cyclic lipopeptide daptomycin fastly. First， the relative molecular weight 1916.7107 of daptomycin was measured by ESI with error 0.0007. The samples doubly charged peak m/z 809.848 was selected as precursor ion for ESI-MS/MS analysis， and the exocyclic amino acid sequence C9H19CO-Trp-Asn-Asp was successfully matched. Second， the experimental conditions of cleaving daptomycin by lithium hydroxide （LiOH） were optimized and the ring-opened process was monitored by MALDI-TOF/TOF MS. After obtaining ring-opened product with purity of above 95%， the MS/MS measurements by MALDI and ESI were carried out. The b+ and y+ of ring-opened product were completely matched， which confirmed the amino acid sequence of daptomycin. Finally， ESI-MS/MS conditions of ring-opened product were further optimized to obtain more low mass fragment ions for analyzing the structure of fatty acid chain and the cleavage pattern of fat chain in mass spectrometry was proposed. The method was fast， convenient， accurate and reliable for identifying cyclic lipopeptide compounds.

Keywords Daptomycin; Cyclic lipopeptide; Tandem mass spectrometry; Electrospray ionization mass spectrometry

（Received 30 April 2014; accepted 22 September 2014）

This work was supported by the National High Technology Research and Development Program 863（Nos. 2012AA020205， 2014AA020906）， the Ministry of Science and Infectious Diseases of Major Projects （No.2013ZX10002009-001-001）， and the National Major Scientific Ruments and Equipments Special Project （No.2012YQ18011710）endprint