定量核磁共振波譜法同時(shí)測(cè)定中藥虎杖中白藜蘆醇和虎杖苷的含量

禹珊+郭強(qiáng)勝+王會(huì)琳+高建平+許旭

摘 要 建立了定量核磁共振波譜法同時(shí)測(cè)定虎杖中白藜蘆醇和虎杖苷的方法。樣品用80%乙醇和丙酮兩次超聲提取凈化，再用定量核磁共振波譜法測(cè)定。考察了樣品預(yù)處理和核磁共振實(shí)驗(yàn)條件對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，選擇氘代二甲亞砜-重水（10∶1， V/V）為溶劑，用基準(zhǔn)物質(zhì)鄰苯二甲酸氫鉀標(biāo)定的2，3，5-三碘苯甲酸為內(nèi)標(biāo)，選擇脈沖延遲時(shí)間為5 s，采樣次數(shù)為32次。定量峰為6.388～6.391 （白藜蘆醇：H-2，6， d， 2H）和6.322～6.330 （虎杖苷：H-4， t， 1H）。結(jié)果表明，NMR測(cè)定的精密度均小于0.6%，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.999， 白藜蘆醇和虎杖苷的檢出限分別為0.23和0.24 g/L，定量限分別為0.69 和1.57 g/L，包括樣品提取過(guò)程的回收率分別為97.7%～103.5%（RSD=2.4%）和94.5%～99.2%（RSD=1.6%），顯示出定量核磁共振法在中藥定量時(shí)的可靠性。實(shí)際測(cè)定4種虎杖飲片及配方顆粒樣品中白藜蘆醇和虎杖苷含量分別為3.57～5.69 mg/g和12.73～24.07 mg/g。

關(guān)鍵詞 定量核磁共振; 虎杖; 白藜蘆醇; 虎杖苷

1 引 言

虎杖為蓼科植物虎杖（Poilgonum cuspidatum Sieb.et Zucc）的干燥根莖及根，主要功效為利濕退黃，清熱解毒，散瘀止痛，具有抗菌抗病毒、擴(kuò)張血管、抗腫瘤、調(diào)節(jié)代謝等藥理作用^[1]。虎杖作為常用中藥已收入中國(guó)藥典^[2]，不久也會(huì)被收入歐洲藥典^[3]。虎杖含有大黃素和大黃素甲醚等蒽醌類(lèi)化合物、白藜蘆醇和虎杖苷（白藜蘆醇苷）等二苯乙烯類(lèi)化合物、鞣質(zhì)和多糖等成分。其中，白藜蘆醇和虎杖苷是虎杖中兩種主要藥效成分^[1，2]（化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1），這兩種成分測(cè)定主要以高效液相色譜^[2，4]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用^[5]為主。

〖TP<06543.tif>，+25mm＼.90mm，Y#〗[TS（][HT5”SS] 〖ZK（〗圖1 白藜蘆醇和虎杖苷的結(jié)構(gòu)式

Fig.1 Chemical structure of resveratrol and polydatin〖ZK）〗[HT5][TS）]

定量核磁共振波譜（Quantitative nuclear magnetic resonance spectroscopy， qNMR）方法簡(jiǎn)單、快捷，實(shí)際樣品測(cè)定時(shí)可以不使用待測(cè)組分的對(duì)照品^[6]。已先后被美國(guó)藥典、英國(guó)藥典^[7]、歐洲藥典收錄，中國(guó)藥典2010版也已收錄^[8]。近幾年來(lái)，qNMR方法已被廣泛用于化學(xué)藥物[9～13]、中藥與植物提取物[14～19]、體液樣品^[20，21]、異構(gòu)體^[22]、食品^[23，24]等的定量分析。

本研究在對(duì)虎杖樣品進(jìn)行有效提取的基礎(chǔ)上，建立了qNMR定量測(cè)定其中白藜蘆醇和虎杖苷兩種藥效成分的方法，考察了實(shí)驗(yàn)條件的影響，對(duì)所建立的方法進(jìn)行了驗(yàn)證， 并用于實(shí)際樣品分析。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Bruker AVANCE III 500MHz核磁共振譜儀（德國(guó)Bruker公司）;M2P精密天平（精度0.001 mg， 德國(guó)Startorius公司）;AB204-N天平（精度0.1 mg，上海世義精密儀器有限公司）;PS-20超聲波清洗儀（東莞市潔康超聲設(shè)備公司）;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠(chǎng)）。

dDMSO（氘代二甲基亞砜， Dimethyl Sulphoxide-D6， 99.9% D）和D2O（重水，Deuterium Oxide， 99.9% D） （Cambridge Isotope Laboratories Inc.）;白藜蘆醇（南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)ZL130705008YY）;虎杖苷（南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)ZL20120907YY）;2，3，5-三碘苯甲酸（Aladdin公司，批號(hào)23527）;鄰苯二甲酸氫鉀（基準(zhǔn)物質(zhì)，99.05%～100.05%，國(guó)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司，批號(hào)20091218） ;無(wú)水乙醇和丙酮（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司）。實(shí)驗(yàn)用水為某品牌蒸餾水。

樣品1為虎杖中藥超微飲片（湖南春光九匯現(xiàn)代中藥有限公司，規(guī)格：1.2 g/袋，批號(hào)130439）;樣品2為虎杖中藥配方顆粒（華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司，規(guī)格：1 g/袋，批號(hào)1109001S）;樣品3為虎杖中藥配方顆粒（江陰天江藥業(yè)有限公司，規(guī)格：1 g/袋，批號(hào)1109081）;樣品4為虎杖中藥飲片 （中藥原產(chǎn)地：浙江，上海華浦中藥飲片有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：XD13032601）。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 樣品制備

虎杖樣品研細(xì)，準(zhǔn)確稱(chēng)取粉末1 g，加入30 mL乙醇-水（4∶1， V/V）搖勻，室溫超聲30 min， 抽濾，濾液于55 ℃水浴旋干。稱(chēng)重后稱(chēng)取部分產(chǎn)物與20 mL丙酮混勻，超聲30 min，抽濾，殘?jiān)貜?fù)丙酮提取一次，合并濾液，于40 ℃水浴上旋干得產(chǎn)物并稱(chēng)重。稱(chēng)取適量產(chǎn)物及內(nèi)標(biāo)2，3，5-三碘苯甲酸于塑料離心管中，加入0.55 mL dDMSO-D2O（10∶1， V/V），混合，超聲2 min，轉(zhuǎn)移至5 mm核磁管中待測(cè)。endprint

2.2.2 核磁共振定量 核磁共振（NMR）采集條件：脈沖序列zg30，脈沖寬度14.4μs。選擇延遲時(shí)間5s，掃描次數(shù)32次，測(cè)定樣品的NMR譜圖。積分時(shí)，先將NMR譜圖基線(xiàn)調(diào)平，選定峰積分區(qū)間，每個(gè)峰積分3～5次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）<1%時(shí)取平均值。用中國(guó)藥典2010版中的絕對(duì)定量公式計(jì)算待測(cè)組分的重量^[9]：

其中Wr為內(nèi)標(biāo)物的重量，As和Ar分別為供試品特征峰和內(nèi)標(biāo)峰的峰面積，Es和Er分別為供試品和內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)子當(dāng)量重量（質(zhì)量）（以分子量除以特征峰的質(zhì)子數(shù)計(jì)算得到），然后根據(jù)稱(chēng)樣量計(jì)算組分在樣品中的含量。

3 結(jié)果與討論

3.1 樣品制備方法的選擇

3.1.1 樣品提取條件的優(yōu)化 虎杖中有效成分提取方法已有不少研究^[25，26]，相對(duì)傳統(tǒng)的醇提法和水提法等，超聲輔助提取法更適用于虎杖中熱敏性物質(zhì)白藜蘆醇和虎杖苷的提取，提取時(shí)間短，提取率高。故采用超聲提取法。

虎杖中的白藜蘆醇和虎杖苷在70～80 ℃時(shí)會(huì)發(fā)生部分分解，強(qiáng)光照射也會(huì)造成部分損失^[26，27]，常溫下穩(wěn)定性良好。故本實(shí)驗(yàn)的超聲提取在室溫進(jìn)行，無(wú)強(qiáng)光照射，提取時(shí)間30 min，旋蒸溫度均在60 ℃以?xún)?nèi)。

根據(jù)文獻(xiàn)[25，26]，以樣品2為研究對(duì)象，先用一種溶劑提取，比較了甲醇、80%甲醇、80%乙醇、丙酮、以及混合溶劑80%乙醇-丙酮（1∶1， V/V）的提取效果。結(jié)果表明， 甲醇、80%甲醇、80%乙醇以及80%乙醇-丙酮（1∶1， V/V）一次提取即可達(dá)到提取完全的效果，但測(cè)試譜圖雜峰較多，影響定量;而丙酮重復(fù)提取3次后仍可檢測(cè)到較高殘留，但譜圖雜峰較少且不干擾待測(cè)組分的定量峰。

因此考慮兩步提取的方式。選擇80%乙醇做第一步完全提取的溶劑;第二步提取選擇丙酮為溶劑凈化產(chǎn)物，結(jié)果表明，丙酮兩次提取即可基本提取完全（第三次提取產(chǎn)物旋蒸后測(cè)組分定量峰信噪比僅為17，殘留很少，基本不影響定量結(jié)果）。

實(shí)驗(yàn)確定樣品提取的條件為：室溫，無(wú)強(qiáng)光照射，80%乙醇一次超聲提取，產(chǎn)物旋干后再經(jīng)丙酮兩次超聲提取，時(shí)間均為30 min。

3.1.2 氘代溶劑

單獨(dú)以dDMSO為溶劑時(shí)，待測(cè)樣品圖譜中白藜蘆醇和虎杖苷的定量峰旁邊存在干擾峰。嘗試dDMSO-D2O混合溶劑，兩定量峰可獲得較好分離，且沒(méi)有干擾。最終選定氘代溶劑為dDMSO-D2O（10∶1， V/V）。

3.2 內(nèi)標(biāo)物的選擇

嘗試了鄰苯二甲酸氫鉀、順丁烯二酸、反丁烯二酸、對(duì)苯二甲醛、苯甲酸、3，5-二硝基苯甲酸、2，3，5-三碘苯甲酸。僅有2，3，5-三碘苯甲酸不與樣品峰互相干擾。故選擇2，3，5-三碘苯甲酸為內(nèi)標(biāo)。

3.3 NMR峰歸屬及定量峰的確認(rèn)

3.3.1 NMR峰歸屬

用2.2節(jié)的方法，分別對(duì)白藜蘆醇、虎杖苷、內(nèi)標(biāo)以及3者的混合物進(jìn)行NMR檢測(cè)。

3.3.2 定量峰確認(rèn)

取樣品1，用2.2節(jié)的方法測(cè)得NMR譜圖（圖3A），與純品混合圖譜（圖2D）比較，選定H-2，6（6.388～6.391， d， 2H） （圖3B中峰1）為白藜蘆醇定量峰;虎杖苷定量峰為H-4（6.322～6.330，t，1H）（圖3B中峰2）;內(nèi)標(biāo)峰為H-6（8.329～8.332，d，1H）（圖3B中IS）。

3.4 對(duì)2，3，5-三碘苯甲酸，白藜蘆醇和虎杖苷的含量校正

以dDMSO-D2O（4∶1， V/V）為溶劑，基準(zhǔn)物質(zhì)鄰苯二甲酸氫鉀的NMR峰H-3，6（7.917～7.935， 2H， dd）與3種純品的NMR定量峰互不干擾，故選其作為校準(zhǔn)2，3，5-三碘苯甲酸（定量峰為H-6（8.189～8.193， 1H， d）），白藜蘆醇（定量峰H-4（6.097～6.105， 1H， t））和虎杖苷（定量峰H-4（6.322～6.330， 1H， t））含量的內(nèi)標(biāo)，采用qNMR絕對(duì)定量模式對(duì)3種純品進(jìn)行含量校正。實(shí)驗(yàn)測(cè)得2，3，5-三碘苯甲酸含量為96.64%，RSD為0.6%;白藜蘆醇純品含量為98.64%，RSD為0.4%;虎杖苷純品含量為98.45%，RSD為0.6%。下面的實(shí)驗(yàn)使用校正后的含量值進(jìn)行。

3.5 方法驗(yàn)證

3.5.1 精密度 稱(chēng)取樣品4制備的旋干產(chǎn)物和內(nèi)標(biāo)，用2.2節(jié)的方法分別在日內(nèi)和日間各做6組測(cè)試，結(jié)果白藜蘆醇峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積（A1/Ar）日內(nèi)RSD為0.2%，日間RSD為0.5%;虎杖苷峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積（A2/Ar）日內(nèi)RSD分別為0.4%，日間RSD為0.5%，精密度好，也說(shuō)明樣品穩(wěn)定性好。

3.5.2 線(xiàn)性

精密稱(chēng)取6組白藜蘆醇0.960～3.318 mg，分別加入虎杖苷0.860～3.500 mg和2 mg內(nèi)標(biāo)，加入0.50 mL溶劑混勻，超聲溶解后按2.2節(jié)的方法獲得NMR譜圖。以（樣品/內(nèi)標(biāo)）質(zhì)量比為橫坐標(biāo)（x），NMR定量峰面積比為縱坐標(biāo)（y），用純品對(duì)照品評(píng)價(jià)的零截距標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)分別為：白藜蘆醇y=4.4368x，相關(guān)系數(shù)R=0.9994;虎杖苷y=1.2885x，R=0.9995。理論計(jì)算線(xiàn)性曲線(xiàn)的斜率對(duì)白藜蘆醇為4.3797，對(duì)虎杖苷為1.2803。兩者接近，可以直接用絕對(duì)定量模式測(cè)定。

3.5.3 檢出限和定量限 qNMR檢出限（LOD）和定量限（LOQ）可由LOD=3.3σ/S，LOQ=10σ/S得到，式中σ指非零截距線(xiàn)性回歸曲線(xiàn)Y軸截距的偏差，S指非零截距線(xiàn)性回歸曲線(xiàn)斜率^[6，17]。由此算得白藜蘆醇LOD=0.057，LOQ=0.173;虎杖苷LOD=0.059，LOQ=0.179。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)中溶劑和內(nèi)標(biāo)的量計(jì)算白藜蘆醇的LOD=0.23 g/L，LOQ=0.69 g/L;虎杖苷LOD=0.24 g/L，LOQ=0.72 g/L。英國(guó)藥典^[8]對(duì)核磁定量方法要求在S/N≥150∶1，這也可以作為L(zhǎng)OQ的指標(biāo)，以樣品1的NMR測(cè)定譜圖，根據(jù)絕對(duì)定量公式^[8]算得白藜蘆醇和虎杖苷的LOQ分別為0.47和1.57 g/L。綜上，本方法qNMR對(duì)白藜蘆醇和虎杖苷的LOQ分別為0.69和1.57 g/L，LOD分別為0.23和0.24 g/L。endprint

3.5.4 樣品分析 按2.2節(jié)的方法，對(duì)市售4種虎杖樣品中測(cè)定白藜蘆醇和虎杖苷的結(jié)果見(jiàn)表1。與相關(guān)文獻(xiàn)[4]中HPLC法測(cè)定飲片中白藜蘆醇（1.1～5.1 mg/g）和虎杖苷（6.3～29.0 mg/g）的含量對(duì)比，本實(shí)驗(yàn)藥材飲片（樣品4）中該兩種成分含量基本相符。

3.5.5 樣品提取后qNMR方法的回收率 取樣品1提取后產(chǎn)物，用2.2節(jié)的qNMR法測(cè)定其中所含白藜蘆醇和虎杖苷的含量; 加入白藜蘆醇和虎杖苷后再測(cè)定含量，計(jì)算加標(biāo)回收率。結(jié)果白藜蘆醇回收率為99.6%～102.3%，RSD為1.0%（n=6）;虎杖苷回收率為98.7%～101.1%，RSD為0.9%（n=6）。

3.5.6 包括樣品提取過(guò)程的白藜蘆醇和虎杖苷回收率

分別準(zhǔn)確稱(chēng)取6份0.5 g左右樣品1，向其中每份均加入精密稱(chēng)取的白藜蘆醇和虎杖苷，用2.2節(jié)的方法提取并測(cè)定含量，計(jì)算回收率。得到包括樣品提取過(guò)程的白藜蘆醇回收率為97.7%～103.5%，RSD=2.4%（n=6）;虎杖苷回收率為94.5%～99.2%，RSD=1.6%（n=6）。考慮qNMR回收率，顯示組分提取較為完全且重現(xiàn)。

研究結(jié)果表明， 本方法可同時(shí)定量分析中藥虎杖中白藜蘆醇和虎杖苷， 方法精密度好，線(xiàn)性評(píng)價(jià)顯示可以直接用絕對(duì)定量公式計(jì)算含量，定量分析結(jié)果準(zhǔn)確。

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Simultaneous Determination of Resveratrol and Polydatin in

Polygonum Cuspidatum by Quantitative Nuclear Magnetic

Resonance Spectroscopy

YU Shan1， GUO Qiang-Sheng1， WANG Hui-Lin2， GAO Jian-Ping2， XU Xu*1，3

1（School of Chemical and Environmental Engineering， Shanghai Institute of Technology， Shanghai 201418， China）

2（Department of Pharmacology， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 201203， China）

3（Key Laboratory of Synthetic Chemistry of Natural Substances， Shanghai Institute of Organic Chemistry，

Chinese Academy of Sciences， Shanghai 200032， China）

Abstract A quantitative nuclear magnetic resonance spectroscopic （qNMR） method was established for the simultaneous determination of resveratrol and polydatin in Polygonum Cuspidatum traditional Chinese herb cuts and granule. The 2-step ultrasonic extraction method using 80% alcohol and acetone was used for fully extracting these two components in samples before qNMR determination. The qNMR experimental conditions were investigated and deuterated dimethyl sulphoxide-deuterium oxide （10∶1， V/V） was selected as solvent， the pulse delay time was 5 s， the scan number was 32， 2，3，5-triiodobenzoate was used as internal standard which was calibrated with primary standard substance of potassium hydrogen phthalate. The 1H-NMR peaks at δ 6.388-6.391 （d， 2H） of resveratrol and δ 6.322-6.330 （t， 1H） of polydatin were chosen as the quantitative peaks. Method validation was performed in terms of precision （RSD<0.6%）， linearity （correlative constants R2>0.999）， limit of detection （0.23 g/L for resveratrol and 0.24 g/L for polydatin） and limit of quantitation （resveratrol 0.69 g/L， polydatin 1.57 g/L）， recovery （resveratrol 97.7%-103.5%， RSD=2.4%， polydatin ?94.5%-99.2%， RSD=1.6%， including the sample extraction and preparaton process）. The results showed the reliability of qNMR for traditional Chinese medicine assay. The resveratrol and polydatin in Polygonum Cuspidatum real cuts and granule samples were experimental determined as 3.57-5.69 mg/g and 12.73-24.07 mg/g， respectively.

Keywords Quantitative nuclear magnetic resonance; Polygonum cuspidatum; Resveratrol; Polydatin

（Received 20 August 2014; accepted 5 October 2014）endprint