超高效合相色譜法同時測定復合維生素片中11種脂溶性維生素及其衍生物

周圍+王波+劉倩倩+楊盛鑫+王麗婷

摘 要 建立了超高效合相色譜法（Ultra performance convergence chromatography，UPC2）分離和測定復合維生素片中11種脂溶性維生素（A， D， E， K）及其衍生物的方法。超高效合相色譜（UPC2）技術集合超臨界流體色譜（Supercritical fluid chromatography，SFC）和超高效液相色譜（Ultra performance liquid chromatography，UPLCTM）的技術優點，流動相以CO2為主體，乙腈為助溶劑梯度洗脫。選用Waters Acquity UPC2 HSS C18 SB色譜柱（100 mm × 3.0 mm 1.8 μm），流速1 mL/min，檢測波長為284 nm。方法檢出限在1.5～2.0 mg/L之間;VK1， VK2， VK3和VD3的線性范圍分別為3～300 mg/L; VA、VA棕櫚酸酯、VA甲酸、VE、VE醋酸酯、VE琥珀酸酯和VD2的線性范圍分別為5～300 mg/L;加標回收率范圍為97.31%～98.76%;相對標準偏差為0.41%～0.96%，可以滿足復合維生素片中11種脂溶性維生素（A， D， E， K）及其衍生物的方法要求。

關鍵詞 超高效合相色譜; 脂溶性維生素; 復合維生素片

1 引 言

脂溶性維生素包括維生素A， D， E， K及其衍生物，是維持機體正常生長、發育、代謝和機體生理功能所必需的物質。維生素A又稱為視黃醇，只存在動物性食品中，具有維持視覺、生殖、細胞生長發育等生理功能^[1];維生素E又稱為生育酚，具有抗氧化、抗衰老、保護血管、促進生育的作用^[2];維生素D為固醇類衍生物，能夠促進鈣在骨骼沉積，具抗佝僂病作用^[3];維生素K又稱抗出血維生素、凝血維生素，具有止血的作用^[4]。如果缺乏或者攝入過量，就會引起代謝失衡，嚴重時會產生缺乏癥疾病，甚至致人死亡^[5]。但是脂溶性維生素在結構上極不穩定，在光照、氧氣、高溫及極端pH的條件下極易被氧化破壞^[6]，因此維生素A， E， D和K的同時測定目前仍然是檢驗技術的難點。

脂溶性維生素的有關測定方法主要有比色法^[7]、熒光法^[8]、分光光度法^[9]、電化學法^[10]、氣相色譜法^[11]、免疫分析法^[12]、高效液相色譜法^[13，14]。目前的國家衛生標準方法也僅限于對這4種維生素進行分別測定，這些方法的特異性不強，有時樣品還要采用復雜的化學、物理或生物前處理，步驟繁雜、費時，而且干擾物質較多、要接觸較多對人體有害的有機溶劑，容易造成維生素被破壞， 導致回收率下降，使測定結果偏低，不能用于多種物質的同時測定。有關同時測定多種脂溶性維生素的方法的文獻很少，僅見于少數幾篇液相色譜-質譜聯用方法[15～17]。超高效合相色譜法（Ultra performance convergence chromatography，UPC2）除了具有傳統超高效液相色譜的優點外，還可與超臨界流體色譜技術結合，以超臨界流體CO2為流動相主體，依靠流動相的溶劑化能力進行分離、分析的色譜過程^[18，19]。加之超細（2 μm）填料技術，能夠通過精確調節流動相強度、壓力和溫度，獲得所需的系統分辨率和選擇性，對待測物的保留和分離進行有效調控，具有操作溫度低、有機溶劑使用量少、靈敏度高、重現性好、分析速度快等優點[20～22]。本研究采用超高效合相色譜法同時測定復合維生素片中的11種脂溶性維生素，在12 min內實現了11種脂溶性維生素（A， D， E， K）及其衍生物的分離。實驗表明，本方法快速、準確、樣品預處理簡便、靈敏度高、重復性好、回收率較高、實用性強，為維生素定性與定量檢測提供了一種高效可行的色譜檢測方法。

2 材料與方法

2.1 儀器與試劑

超高效合相色譜儀（美國Waters公司），配有Waters EmpowerTM 3數據處理系統;3K30冷凍離心機（美國Sigma公司）;MS3渦旋儀（德國IKA公司）;移液槍（美國Thermo Electron公司，100～1000 μL、20～100 μL）。

維生素K1（純度98.5%）、維生素K2（純度99.5%）、維生素K3（純度99.5%）、維生素A（純度98.5%）、維生素A棕櫚酸酯（純度98%）、維生素A甲酸（純度99%）、維生素E（純度98.3%）、維生素E醋酸酯（純度98.5%）、維生素E琥珀酸酯（純度97.5%）、維生素D2（純度98%）、維生素D3（純度99.5%），德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司;CO2（純度99.997%，蘭州匯能公司）;甲醇、乙腈、異丙醇、正己烷（色譜純， 德國Merck KGaA公司）;石油醚（分析純，天津登峰公司）;蒸餾水;復合維生素（美國安利紐崔萊公司）。

2.2 標準溶液配制

標準貯備液：精確稱取每種維生素各0.030 g，用正己烷-異丙醇（8∶2， V/V）溶液溶解并定容至100 mL，配制成300 mg/L的標準儲備液，4 ℃下冷藏待用（4 h后重新配制）。endprint

標準工作液：準確轉移1000， 834， 500， 250， 100和25 μL標準貯備液，分別稀釋為300， 250， 150， 75， 30， 7.5， 5.0， 1.0， 0.5和0.3 mg/L的標準工作液，4℃下冷藏待用（4 h后重新配制） 。

2.3 超高效合相色譜條件

Waters Acquity UPC2 HSS C18 SB色譜柱：（100 mm×3.0 mm， 1.8 μm），流動相：A為CO2， B為乙腈;梯度洗脫： 0～3 min， 95% A; 3～7 min， 85% A; 7～10 min， 60% A; 10～10.2 min， 60%～95% A; 10.2～12 min， 95% A。流速1 mL/min;進樣量 1 μL;柱溫50 ℃;檢測波長284 nm;動態背壓（ABPR）： 1900 psi。

2.4 樣品處理

復合維生素片劑：準確稱取2.0 g研磨后的復合維生素片，于15 mL聚乙烯管中，加入10 mL異丙醇-正己烷（1∶1， V/V）溶液，用渦旋振蕩器振搖10 min充分混勻后，高速冷凍離心機于4 ℃下以13000 r/min離心10 min， 取1 mL上清液，經0.22 μm濾膜過濾后，直接進樣分離分析。

復合維生素膠囊：準確稱取復合維生素膠囊內的油狀液體1.0 g于15 mL聚乙烯管中，加入10 mL異丙醇-正己烷（1∶1， V/V）溶液，用渦旋振蕩器振搖10 min充分混勻，經0.22 μm濾膜過濾后，直接進樣分離分析。

3 結果與分析

3.1 11種脂溶性維生素（A， D， E， K）及其衍生物的標準色譜圖

使用HSS C18 SB柱時，在2.3節的色譜條件下分析濃度為75 mg/L的標準溶液，得到標準色譜圖（圖1）。

3.2 色譜分離條件的優化

3.2.1 色譜柱的選擇 為了使11種脂溶性維生素（A， D， E， K）及其衍生物在較短時間內達到分離，并具有良好峰形，比較了Waters Acquity UPC2 BEH 2-EP （150 mm×2.1 mm i.d.， 1.7 μm）和Waters Acquity UPC2 HSS C18 SB（100 mm×3.0 mm i.d.， 1.8 μm）這兩種色譜柱對11種脂溶性維生素（A， D， E， K）及其衍生物分離的影響。

使用BEH 2-EP柱（圖2）時，11種脂溶性維生素（A， D， E， K）及其衍生物出峰不完全，其中VE琥珀酸酯、VE醋酸酯未出峰，而且VK1、VK2與VA棕櫚酸酯出峰完全重疊，VD2和VD3色譜峰粘連在一起，分離效果不理想;當使用HSS C18 SB柱（圖1）時，11種脂溶性維生素（A， D， E， K）及其衍生物在8 min內出峰完全，且峰形尖銳，相互之間無影響。因此，選擇Waters Acquity UPC2 HSS C18 SB色譜柱進行分離。

3.2.2 流速的選擇

超臨界CO2作為流動相時，由于其黏度低，擴散系數高，使它在分離過程中具有較高的線速度，流速越大，被分離物質出峰時間越快，峰型尖銳，靈敏度增加，較小的流速會造成分析時間過長，峰展寬較大，影響靈敏度，故本實驗通過使用超高效合相色譜，對亞2 μm填料的色譜柱的流速在0.6～1.2 mL/min 范圍內進行優化。當流速為1.2 mL/min時，VE醋酸酯、VK1、VK2、VD2及VD3會因為流速過快而無法分離，或達不到分離要求;當流速為0.6 mL/min時，分離時間長達15 min，不能做到快速、高通量分析。為了保證較好的靈敏度、色譜柱壓力以及盡可能與雜質分離，本實驗最佳流速選擇為1 mL/min。

3.2.3 助溶劑的選擇

由于UPC2的流動相主要是CO2超臨界流體，助溶劑的選擇對于目標化合物的峰形及保留時間起著至關重要的作用，為了調整流動相對不同目標化合物的不同溶解性，通常加入甲醇、乙醇、乙腈、異丙醇、乙酸乙酯等助溶劑，有效改變目標化合物的峰形及保留時間。本試驗分別選用了甲醇、乙醇和乙腈3種常用的不同極性的助溶劑，對相同濃度的11種脂溶性維生素（A， D， E， K）及其衍生物進行分離。結果表明，隨著助溶劑極性的增加，流動相的溶解能力也相應得到增強，使得11種脂溶性維生素（A， D， E， K）及其衍生物的出峰時間提前。在使用甲醇為助溶劑時，由于甲醇較大的極性使得部分維生素（如維生素K1、維生素A甲酸）在流動相中的溶解能力降低而出現色譜峰分叉;使用極性較弱的乙醇作為助溶劑時，部分維生素（如VK1和VK2、VD2和VD3）不能很好地分離，且由于流動相的溶解能力使VA甲酸峰分叉。當選用助溶劑為乙腈時，11種脂溶性維生素（A， D， E， K）及其衍生物在較短的時間內達到較好的分離，并具有較好的峰型，因此，本實驗選擇乙腈為助溶劑。

3.2.4 動態背壓（ABPR）的選擇

超高效合相色譜中，動態背壓（ABPR）是影響分離過程的重要因素之一。它主要作用是控制CO2在整個操作過程中的超臨界流體狀態。不同的動態背壓下，CO2超臨界流體對各種樣品有著不同的溶解能力。當背壓升高時，超臨界流體密度會增大，溶劑化能力增強，柱壓升高，分析物保留時間提前。本實驗考察了背壓在1800～2200 psi范圍內CO2超臨界流體對樣品分離度的影響。結果表明，隨著背壓的增加，CO2超臨界流體密度、黏度隨之增加，柱壓升高，當背壓為2200 psi時，VE醋酸酯、VK1、VK2、VD2以及VD3分離度達不到分離要求。當背壓為1800 psi時，因為CO2超臨界流體溶劑化能力的降低，使得VD2和VD3色譜峰分叉，分析時間增加。通過對樣品基質、保留時間、峰形及色譜柱壓力的綜合考慮，當背壓為1900 psi時，11種脂溶性維生素（A， D， E， K）及其衍生物相互之間分離情況最好，保留時間較短、峰形對稱，故本實驗選擇動態背壓為1900 psi。endprint

3.2.5 色譜柱溫度的選擇 溫度對CO2超臨界流體影響也較大，一般在30～50℃之間進行選擇。隨著溫度升高，超臨界流體的黏度降低，溶劑化能力減小，出峰時間延長。隨著溫度降低，超臨界流體黏度增加，溶劑化能力增強，出峰時間縮短;為了使樣品中11種脂溶性維生素（A， D， E， K）及其衍生物得到較好的分離，本實驗在保持其它色譜條件不變的前提下，在30～50℃ 范圍內考察了柱溫對目標物分離的影響。結果表明，隨著溫度的升高，11種脂溶性維生素（A， D， E， K）及其衍生物的保留時間逐漸增加，當溫度為30 ℃時，雖然目標物均得到分離，但是柱壓較高且重現性較差。當溫度為50 ℃時，保證了脂溶性維生素（A， D， E， K）及其衍生物在分析過程中相互之間不干擾，并且具有較好的重現性。故本實驗最佳分離溫度選擇50 ℃。

3.3 方法學考察

3.3.1 線性范圍和靈敏度 將11種脂溶性維生素（A， D， E， K）及其衍生物系列標準工作液按2.3節色譜條件進行測定，繪制樣品濃度（x，mg/L）與峰面積（y）標準曲線，進行線性回歸分析，且當信噪比為3（S/N=3）時，方法對11種脂溶性維生素（A， D， E， K）及其衍生物的檢出限（LOD）分析結果如表1所示。結果表明，本方法在表1所列的線性范圍內，線性良好。

3.3.2 樣品加標回收率和精密度 在空白樣品中添加5， 10和50 mg/L的維生素標準溶液，渦旋混合，放置20 min，按2.4節進行前處理操作后，按2.3節進樣測定，以濃度值計算加標回收率。為得到11種脂溶性維生素（A， D， E， K）及其衍生物的精密度，對每一添加濃度樣品重復測定8次。各維生素的加標回收率在97.31%～98.76%之間，相對標準偏（RSD）為0.41%～0.96%。方法的回收率和重現性均較好。

3.3.3 實際樣品測定 在上述優化實驗條件下，對維生素含量進行了分析，采用與標準保留時間相對照，外標法定量的方法測得兩種復合維生素片（膠囊）中維生素的色譜圖（圖3），分析結果見表2。在本實驗設定條件下樣品及標樣均能得到較好分離。

行檢測，前處理過程簡單，分析時間短，結果可靠，有效避免脂溶性維生素在長時間、復雜、繁瑣的前處理及檢測過程中的損失，導致定量不準確、實驗過程誤差較大的弊端，提高了脂溶性維檢測的準確性。由于流動相為CO2超臨界流體，對環境污染小，運行成本低。本方法為多種脂溶性維生素在食品中的同時檢測分析提供了技術支持。超高效合相色譜（UPC2）將為未來的色譜分析提供新的方向。

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Determination of 11 Fat-soluble Vitamins （A， D， E， K） and

Their Derivatives in Vitamin Tablets by Ultra Performance

Convergence Chromatography

ZHOU Wei*1，2，3， WANG Bo1， LIU Qian-Qian2， YANG Sheng-Xin3， WANG Li-Ting3

1（Central Laboratory of Technical Center of Gansu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Lanzhou 730000， China）

2（College of Food Science and Engineering， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， China）

3（College of Geography and Environment Science， Northwest Normal University， Lanzhou 730070， China）

Abstract A new method was developed for the determination of 11 fat-soluble vitamins （A， D， E and K） and its derivatives in vitamin tablets by ultra performance convergence chromatography （UPC2）. The mobile phase was the mixture of supercritical CO2 and acetonitrile at a flow rate of 1 mL/min. The separation was carried out on the Waters Acquity UPC2 HSS C18 SB 100 mm× 3.0 mm i.d.， 1.8 μm column. The UV detector was set at a wavelength of 284 nm. The limits of detection （LOD） were 1.5-2.0 mg/L， and the calibration linear for VK1， VK2， VK3 and VB3 was 3-300 mg/L， linear for VA， VA palmitate， VA formic acid， VE， VE acetate， VD2 and VD3 was 5-300 mg/L， respectively. Its spiked recoveries were 97.31%-98.76%， and the relative standard deviations （RSDs） were 0.41%-0.96%. The method is applicable for the determination of fat-soluble vitamins （A， D， E and K） and Their derivatives in vitamin tablets.

Keywords Ultra performance convergence chromatography; Fat-soluble Vitamin; Vitamin tablets

（Received 23 May 2014; accepted 28 September 2014）endprint