液相色譜—串聯質譜法測定人工模擬豬消化液中3種霉菌毒素

王瑞國+蘇曉鷗

摘 要 建立了液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS）同時測定人工模擬豬胃和小腸消化液中黃曲霉毒素B1（AFB1）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）和玉米赤霉烯酮（ZEA）的快速、靈敏方法，并將此方法應用于霉菌毒素吸附劑吸附率體外法評價。通過模擬豬的消化道對飼料基質進行體外消化獲得豬胃和小腸消化液，分別向其中按一定比例添加霉菌毒素吸附劑和3種霉菌毒素，孵育、離心后，經進樣液10倍稀釋后測定。采用反相C18色譜柱分離，以0.2 mmol/L乙酸銨溶液和0.1%甲酸-甲醇溶液作為流動相，梯度洗脫，多反應監測離子模式（MRM）檢測，同位素內標法定量。在優化條件下，對AFB1， DON和ZEA在人工豬胃和小腸消化液中的定量限分別是1， 50， 40 μg/L和0.3， 50， 20 μg/L，相對偏差（RSD）<5.0%。并且，在39 ℃±0.5 ℃，10 h內測定結果穩定，能夠滿足霉菌毒素吸附劑吸附率的測定。采用本方法對市售8種蒙脫石類吸附劑和5種酵母細胞壁類吸附劑進行吸附率評價。

關鍵詞 液相色譜-串聯質譜; 模擬豬消化液; 霉菌毒素; 霉菌毒素吸附劑

1 引 言

霉菌毒素（Mycotoxins）是由霉菌產生的次級代謝產物，一旦被動物采食會產生一系列毒性效應^[1]。飼料特別易于被各種霉菌毒素污染^[2，3]，而霉菌毒素吸附劑是消除飼料中、低劑量霉菌毒素對動物影響的有效手段^[4]。對特定毒素的吸附率是霉菌毒素吸附劑評價的最重要指標，但是吸附率的評價尚沒有一致的方法。目前，霉菌毒素吸附劑吸附率的評價存在以下問題： （1）評價方法 吸附率的測定通常分為體外和體內兩種。體外方法一般以緩沖液為介質，測定吸附劑對某種霉菌毒素的吸附能力，這種方法在吸附劑初步評價和吸附潛力篩選方面得到廣泛應用。但是，由于經常與體內方法的評價結果不一致，從而降低了可信度^[5]。體內法采用動物生產性能或生物標記物等間接指標來評價吸附劑效果，因為很多因素和實驗條件都可影響最終結果，導致了評價結果不穩定^[6]。（2）毒素檢測方法 絕大部分霉菌毒素吸附劑吸附率評價采用的是高效液相色譜（HPLC）法^[7，8]，靈敏度相對液質聯用而言較低，測定步驟多，過程繁瑣，同步測定多種毒素的能力較差。也有采用酶聯免疫試劑盒（ELISA）法進行評價[9～11]，結果可靠性差。（3）吸附對象 大部分霉菌毒素吸附劑吸附率測定對象采用AFB1^[12]，其原因主要是AFB1較其他毒素更易于被吸附^[13]。事實上，75%的飼料同時被多種毒素污染，且以DON、ZEA等為主[14， 15]。但是，多數種類的霉菌毒素吸附劑對DON和ZEA等吸附效果一般，甚至無效^[16]。體內實驗也表明，對AFB1吸附效果良好的一種吸附劑在同時受到多種霉菌毒素污染的飼料中使用效果不佳^[17]。而且，吸附劑對霉菌毒素是非特異性吸附，飼料中的其他成分很可能會干擾吸附效果^[18]。

霉菌毒素吸附劑吸附率評價的關鍵在于評價體系和霉菌毒素檢測。目前，液相色譜串聯質譜法（LC-MS/MS）在食品和飼料中多種霉菌毒素同步檢測上得到了廣泛應用^[19]，但尚未見LC-MS/MS法用于霉菌毒素吸附劑體外吸附率測定的文獻報道。本研究針對上述3個問題，通過模擬豬消化道環境和飼料基質特點制備了人工豬胃和小腸消化液，將飼料中霉菌毒素以外的其它成分引入吸附率評價體系中，并應用LC-MS/MS同時對3種主要毒素進行測定，能夠更加全面、準確地測定霉菌毒素吸附劑的吸附率。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

TQD超高效液相色譜-串聯質譜儀（美國Waters公司）; RVC 2-18臺式離心濃縮儀（德國Christ公司）; 3K15高速冷凍離心機（美國Sigma公司）; ZWY-200D恒溫培養振蕩器（上海智誠分析儀器制造有限公司）; D37520高速離心機（美國Kendro公司）。

AFB1， DON和ZEA標準品（純度≥99%，以色列Fermentek公司）; 同位素內標13C17-AFB1、13C15-DON、13C18-ZEA（ROMER公司）; MilliQ超純水; 乙腈、甲醇、乙酸銨和甲酸（色譜純，美國Fisher公司）; 胃蛋白酶、胰蛋白酶、豬膽鹽、氯化鈉等常規試劑（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。霉菌毒素吸附劑從市場購買，其中主成分為蒙脫石類的8種產品，分別標識為浙江三鼎科技有限公司、攀枝花興加環保技術有限公司、赤峰和正美化工有限公司、赤峰市物華天寶礦物材料有限公司、浙江豐虹新材料股份有限公司、壽光中聯精細蒙脫石有限公司、內蒙古天源蒙脫石開發有限公司和內蒙古潤隆化工有限責任公司;主成分為酵母細胞壁類的5種產品，分別標識為廣東江門生物技術開發中心有限公司、北京優利保生物科技與技術有限責任公司、巴西ICC公司、上海滬鼎生物科技有限公司、安琪酵母股份有限公司。生長豬配合飼料樣品由國家飼料質量監督檢驗中心（北京）惠贈。

2.2 溶液配制

2.2.1 霉菌毒素混合標準溶液的配制 分別準確移取濃度為1000 mg/L的AFB1，DON，ZEA 50，500和200 μL，用乙腈定容至10 mL，配制成為濃度分別為5，50和20 mg/L的霉菌毒素混合標準儲備液，

2.2.2 混合同位素內標進樣液的配制 分別準確移取400， 400和200 μL的13C17-AFB1（500 μg/L）、13C15-DON（25 mg/L）、13C18-ZEA（25 mg/L）置于2 mL離心管中，40 ℃條件下用離心濃縮儀1500 r/min旋干，進樣液（0.2 mmol/L乙酸銨溶液-乙腈-甲酸，95∶4.9∶0.1， V/V）復溶，超聲溶解2 min，移取并用進樣液定容至100 mL，4 ℃保存。

2.2.3 人工豬胃消化液的制備

稱取NaCl 2 g，胃蛋白酶3.2 g，量取36.5%濃HCl 7 mL，加水至1000 mL， 混勻，制得人工胃液。稱取適量生長豬配合飼料于三角瓶中，按照質量體積比1∶3向其中加入人工胃液，用HCl調至pH=2.0±0.5，置于39 ℃±0.5 ℃恒溫振蕩器中220 r/min孵育1 h，靜置1 min，轉移上清液，并10000 r/min離心10 min，收集上清液于1000 mL試劑瓶，4 ℃保存待用。

2.2.4 人工豬小腸消化液的制備

稱取KH2PO4 6.8 g，加水500 mL使溶解，用0.1 mol/L NaOH溶液調至pH 6.8，稱取胰酶10 g，加水使溶解，將兩溶液混合后，另加3 g豬膽鹽，加水稀釋至1000 mL，制得人工小腸液。將3倍體積的人工小腸液加入到人工胃液消化液制備時剩余的飼料沉淀中，置于39 ℃±0.5 ℃恒溫振蕩器中220 r/min孵育1 h，靜置1 min，轉移上清液， 并10000 r/min離心10 min，收集上清液于1000 mL試劑瓶，4 ℃保存待用。

2.3 樣品處理

移取霉菌毒素混合標準儲備液40 μL于50 mL 旋蓋塑料離心管中，40 ℃氮氣吹干，加入5 mL人工豬胃消化液復溶，再向其中準確加入霉菌毒素吸附劑4 mg±0.1 mg，渦旋混勻1 min，迅速水浴加熱至39 ℃±0.5 ℃，然后置于恒溫振蕩器中39 ℃±0.5 ℃，220 r/min振蕩孵育1 h，立即取出冷卻靜置。取1 mL上清液，13000 r/min離心5 min，取50 μL上清液與450 μL混合同位素內標進樣液渦旋混勻，上機測定平衡后體系中游離毒素的濃度。每種吸附劑吸附率的測定設3個平行，并設不添加霉菌毒素吸附劑的基質校正組，人工小腸液消化液中游離毒素濃度測定步驟同上。吸附率（%）的計算公式為Y=（1- Ceq/C0） ×100%，式中Y為吸附率，C0為毒素初始（即基質校正組）濃度， Ceq為平衡后體系中游離毒素的濃度。

2.4 色譜和質譜條件

Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國Waters公司）; 柱溫40 ℃，流速0.40 mL/min， 進樣量5 μL。流動相A為0.2 mmol/L乙酸銨溶液，流動相B為0.1%甲酸-甲醇。梯度洗脫：0～0.5 min，90% A; 0.5～1.5 min，70% A; 1.5～2.5 min，40% A; 2.5～3.5 min，30% A; 3.5～4.0 min， 20% A; 4.0～4.2 min，90% A; 4.2～5.0 min，90% A。

電噴霧離子源（ESI），離子源溫度為150℃，脫溶劑溫度為450 ℃，脫溶劑氣和錐孔氣均為N2，脫溶劑氣流速為900 L/h，錐孔氣流速為20 L/h。AFB1和DON采用正離子監測，ZEA采用負離子監測方式，毛細管電壓為0.75 kV。采用多反應監測方式（MRM）檢測，監測離子、碰撞能量、錐孔電壓等參數見表1。

3 結果與討論

3.1 質譜條件的優化

以甲醇-水（50∶50， V/V）為流動相，采用結合進樣方式，對3種霉菌毒素及其同位素內標的質譜條件進行優化，在正負離子模式下進行全掃描，選擇合適的準分子離子峰和電離方式。其中，AFB1和DON的準分子離子為正電離模式下獲得的[M+H]+，ZEA因含有酚羥基結構，其準分子離子為負電離模式下獲得的[M-H]

2.2.2 混合同位素內標進樣液的配制 分別準確移取400， 400和200 μL的13C17-AFB1（500 μg/L）、13C15-DON（25 mg/L）、13C18-ZEA（25 mg/L）置于2 mL離心管中，40 ℃條件下用離心濃縮儀1500 r/min旋干，進樣液（0.2 mmol/L乙酸銨溶液-乙腈-甲酸，95∶4.9∶0.1， V/V）復溶，超聲溶解2 min，移取并用進樣液定容至100 mL，4 ℃保存。

2.2.3 人工豬胃消化液的制備

稱取NaCl 2 g，胃蛋白酶3.2 g，量取36.5%濃HCl 7 mL，加水至1000 mL， 混勻，制得人工胃液。稱取適量生長豬配合飼料于三角瓶中，按照質量體積比1∶3向其中加入人工胃液，用HCl調至pH=2.0±0.5，置于39 ℃±0.5 ℃恒溫振蕩器中220 r/min孵育1 h，靜置1 min，轉移上清液，并10000 r/min離心10 min，收集上清液于1000 mL試劑瓶，4 ℃保存待用。

2.2.4 人工豬小腸消化液的制備

稱取KH2PO4 6.8 g，加水500 mL使溶解，用0.1 mol/L NaOH溶液調至pH 6.8，稱取胰酶10 g，加水使溶解，將兩溶液混合后，另加3 g豬膽鹽，加水稀釋至1000 mL，制得人工小腸液。將3倍體積的人工小腸液加入到人工胃液消化液制備時剩余的飼料沉淀中，置于39 ℃±0.5 ℃恒溫振蕩器中220 r/min孵育1 h，靜置1 min，轉移上清液， 并10000 r/min離心10 min，收集上清液于1000 mL試劑瓶，4 ℃保存待用。

2.3 樣品處理

移取霉菌毒素混合標準儲備液40 μL于50 mL 旋蓋塑料離心管中，40 ℃氮氣吹干，加入5 mL人工豬胃消化液復溶，再向其中準確加入霉菌毒素吸附劑4 mg±0.1 mg，渦旋混勻1 min，迅速水浴加熱至39 ℃±0.5 ℃，然后置于恒溫振蕩器中39 ℃±0.5 ℃，220 r/min振蕩孵育1 h，立即取出冷卻靜置。取1 mL上清液，13000 r/min離心5 min，取50 μL上清液與450 μL混合同位素內標進樣液渦旋混勻，上機測定平衡后體系中游離毒素的濃度。每種吸附劑吸附率的測定設3個平行，并設不添加霉菌毒素吸附劑的基質校正組，人工小腸液消化液中游離毒素濃度測定步驟同上。吸附率（%）的計算公式為Y=（1- Ceq/C0） ×100%，式中Y為吸附率，C0為毒素初始（即基質校正組）濃度， Ceq為平衡后體系中游離毒素的濃度。

2.4 色譜和質譜條件

Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國Waters公司）; 柱溫40 ℃，流速0.40 mL/min， 進樣量5 μL。流動相A為0.2 mmol/L乙酸銨溶液，流動相B為0.1%甲酸-甲醇。梯度洗脫：0～0.5 min，90% A; 0.5～1.5 min，70% A; 1.5～2.5 min，40% A; 2.5～3.5 min，30% A; 3.5～4.0 min， 20% A; 4.0～4.2 min，90% A; 4.2～5.0 min，90% A。

電噴霧離子源（ESI），離子源溫度為150℃，脫溶劑溫度為450 ℃，脫溶劑氣和錐孔氣均為N2，脫溶劑氣流速為900 L/h，錐孔氣流速為20 L/h。AFB1和DON采用正離子監測，ZEA采用負離子監測方式，毛細管電壓為0.75 kV。采用多反應監測方式（MRM）檢測，監測離子、碰撞能量、錐孔電壓等參數見表1。

3 結果與討論

3.1 質譜條件的優化

以甲醇-水（50∶50， V/V）為流動相，采用結合進樣方式，對3種霉菌毒素及其同位素內標的質譜條件進行優化，在正負離子模式下進行全掃描，選擇合適的準分子離子峰和電離方式。其中，AFB1和DON的準分子離子為正電離模式下獲得的[M+H]+，ZEA因含有酚羥基結構，其準分子離子為負電離模式下獲得的[M-H] Symbolm@@ 。有文獻報道， DON采用加乙酸根離子^[20]或減氫^[21]的電離模式，但研究顯示DON加氫模式同樣能獲得很好的響應。結合基質空白和基質標準液的離子掃描圖，進一步優化確定了各種毒素的特征離子對等參數（表1）。

3.2 色譜條件優化

流動相的組成和配比不但影響目標化合物的色譜行為，還影響著目標化合物離子化效率和靈敏度。實驗考察了0.2 mmol/L乙酸銨溶液/0.1%甲酸-甲醇（A）、0.2 mmol/L乙酸銨溶液/乙腈（B）、0.1%甲酸/0.1%甲酸-甲醇（C）、0.1%甲酸/乙腈（D）4種流動相體系對3種霉菌毒素的分離效果和峰信號強度。結果表明，3種毒素在A流動相體系下色譜峰分離效果好，信號峰響應值最高（表2）。進一步優化流動相條件，采用梯度洗脫，優化色譜條件下5 min內完成樣品檢測。3種霉菌毒素及其同位素內標的分離效果（以人工胃液為例）見圖1。

3.3 基質效應

由于對樣品采取稀釋10倍的方法上機測定，沒有進行凈化處理，所以LC-MS/MS檢測時有較強的基質效應。分別配制高中低3個濃度毒素添加的人工豬胃和小腸消化液，與進樣濃度相同的標準溶液峰面積比較，計算外標法和內標法的基質效應（表3）。結果表明，采用外標法定量3種毒素的基質效應較強，精密度較差; 而采用內標法定量可較好地消除基質效應，提高精密度。雖然在吸附率評價中可采用基質加標校正曲線對目標物進行定量計算，但是考慮到基質效應會降低方法的線性、準確度和精密度^[22]，以及不同吸附劑可能帶來的基質效應差異，所以本研究采用內標法定量以消除基質效應的干擾。

3.4 線性方程、相關系數、定量限和精密度

準確移取100，40，20，10，5和2.5 μL霉菌毒素標準儲備液，室溫下氮氣吹干，分別用5 mL人工胃液和小腸液消化液溶解制成系列

3.5 穩定性

霉菌毒素在體系中的穩定性是吸附率評價的重要影響因素。考察了3種霉菌毒素在人工豬胃和小腸消化液中39 ℃±0.5 ℃孵育10 h內的穩定性。按照2.3節處理樣品，不添加霉菌毒素吸附劑，振蕩孵育時間分別設為1， 2， 5和10 h，以孵育1 h時毒素峰面積和內標峰面積的比值為100%，其它時間點的測定結果介于95.9%～111.3%。結果表明，在試驗溫度條件下10 h內3種毒素在評價體系中不產生降解，能夠穩定存在。

3.6 實際樣品測定

以豬胃腸液與飼料比為3計，按照2.3節處理樣品，相當于在AFB1， DON和ZEA污染濃度120， 1200和480 μg/kg的配合飼料中添加了0.24%的霉菌毒素吸附劑，這與生產實際狀況比較接近。采用本方法對市售8種蒙脫石類吸附劑和5種酵母細胞壁類吸附劑進行評價，兩類吸附劑產品在人工模擬豬胃消化液中對3種霉菌毒素的吸附率分別為85.1%～96.5%（AFB1）， 8.1%～14.7%（DON）， 13.7%～30.0%（ZEA）和7.4%～16.6%（AFB1）， 6.9%～16.2%（DON）， 18.6%～39.0%（ZEA），在人工模擬豬小腸消化液中對3種霉菌毒素的吸附率分別為76.2%～93.0%（AFB1）， 12.3%～31.3%（DON）， 0%～23.2%（ZEA）和8.6%～13.4%（AFB1）， 3.8%～23.5%（DON）， 24.9%～34.8%（ZEA）。測定結果符合兩類吸附劑對不同毒素的吸附性質，與文獻[4～6]報道的結論基本一致，表明本方法能夠用于霉菌毒素吸附劑吸附率的測定。

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Rapid and Sensitive LC-MS/MS Determination of Aflatoxin B1，

Deoxynivalenol， Zearalenone in Artificial Porcine

Gastrointestinal Digested Juices

WANG Rui-Guo， SU Xiao-Ou， FAN Xia， WANG Pei-Long， GAO Zhong-Wu， ZHANG Yu

（Institute of quality standards and testing technology for agricultural products， Chinese Academy of Agricultural Science，

Key laboratory of agrifood safety and quality， Ministry of AgricuLture， P.R.China， Beijing 10081， China）

Abstract A rapid liquid chromatography-tandem mass spectrometric （LC-MS/MS） method was developed for the determination of aflatoxin B1（AFB1）， Deoxynivalenol （DON）， Zearalenone ?（ZEA） in artificial porcine gastrointestinal digested juices， as pigs reacted most sensitively to these mycotoxins. The formula feed was digested by artificial gastric and intestinal juices respectively， then the mycotoxins and adsorbent were added in ratio. After incubation and centrifugation， the supernatant was diluted 10-folds by injection solution and analyzed by LC-MS/MS. The 3 analytes were separated on a reversed phase C18 column using a gradient elution program of aqueous solution containing 0.2 mmol/L ammonium acetate and 0.1% formic acid methanol. Qualitative analysis was performed using multiple-reaction monitoring （MRM）， and quantitative analysis was by internal standard method. Under optimum conditions， the limit of quantitation （LOQ） of AFB1， DON， ZEA was 1， 50， 40 and 0.3， 50， 20 μg/L in artificial gastric and intestinal digested juices respectively， and the relative standard deviations （RSDs） were below 5.0%. Then， the thermal stability was studied by incubating the analytes at 39 ℃±0.5 ℃ for 1， 2， 5 and 10 h， and the results showed 3 analytes were stable under the conditions. Furthermore， the method was applied to evaluate the binding efficacy of 8 mineral benders and 5 organic adsorbents. The adsorbents demonstrated binding efficacy of 85.1%-96.5%， 8.1%-14.7%， 13.7%-30.0% and 7.4%-16.6%， 6.7%-16.2%， 18.6%-39.0% in gastric digested juice， and 76.2%-93.0%， 12.3%-31.3%， 0%-23.2% and 8.6%-13.4%， 3.8%-23.5%， 24.9%-34.8% in intestinal digested juice for these 3 mycotoxins， respectively， with 2 kinds of adsorbents.

Keywords Liquid chromatography-tandem mass spectrometry; Artificial porcine gastrointestinal digested juice; Mycotoxin; Adsorbent

（Received 7 August 2014; accepted 4 October 2014）