干細胞與脊髓損傷的治療

韓倩倩 許 琰 王 宏 黃經春

干細胞與脊髓損傷的治療

韓倩倩 許 琰 王 宏 黃經春

脊髓損傷的治療一直是世界性的難題，促進脊髓損傷后神經組織的修復，傳統的手術和相應的輔助治療并未取得突破性進展。組織工程學的發展，為神經組織的修復提供了良好的可能。被移植到患者脊髓損傷區域的干細胞，通過替換受損細胞、減少膠質瘢痕的形成、促進殘存神經元細胞軸突再生及突觸形成等，可促進脊髓形態及功能恢復。我們就目前應用干細胞治療脊髓損傷的研究現狀進行概述，并對其臨床應用前景進行展望。

脊髓損傷干細胞組織工程

脊髓損傷（Spinal cord injury，SCI）的治療一直是世界性的難題，不僅給患者及其家庭帶來重創，也給社會增加了沉重的負擔。近年來，交通與工傷事故分居脊髓損傷發病率的前二位[1]。促進脊髓損傷后神經組織的修復，傳統的手術和相應的輔助治療并未取得突破性進展。組織工程學的發展，為神經組織的修復提供了可能。組織工程支架聯合干細胞或單獨使用干細胞的治療方式在動物實驗中取得了很好的效果。被移植到患者脊髓損傷的區域的干細胞，通過替換受損細胞、減少膠質瘢痕的形成、促進殘存神經元細胞軸突再生及突觸形成等，可促進脊髓形態及功能恢復。

脊髓損傷分為原發性損傷和繼發性損傷。原發性損傷即為初始的機械性損傷；繼發性損傷由特殊的細胞和分子機制構成，包括谷氨酸興奮性毒性、自由基生成、脂質過氧化、炎癥和缺血（最終導致損傷周圍的神經細胞凋亡、脊髓壞死）等，最終導致脊髓損傷部位不同程度的脫髓鞘和脊髓空化。

以往的治療主要包括局部冷凍、手術減壓、手術吻合、神經移植等前期外科治療，藥物治療，物理康復，以及應用酶制劑來抑制和消除結締組織瘢痕等后期治療。手術減壓可恢復受損區域的穩定性，藥物治療在抑制或減輕其繼發性損傷中具有一定作用，物理、心理、康復、營養等綜合治療亦可對功能些許促進作用。但是，在促進患者功能恢復上并未取得顯著的突破性進展。

眾所周知，神經系統損傷到傷后功能恢復的關鍵是細胞的存活、軸突的再生、再生軸突生長方向的準確定位和修復精確而有功能的突觸聯系。自Reynolds等[2]從鼠的神經組織中提取出了具有分化潛能的神經干細胞開始，脊髓損傷的治療走向了細胞治療的方向，給脊髓損傷的治療帶來了希望。干細胞移植治療脊髓損傷的方式大體有3種，即局部種植、經靜脈注射途徑和腰穿途徑。脊髓損傷急性期治療中，由于傷后1~2周內，損傷區域的微環境最適合干細胞的生長及分化，故此時為最佳移植時間段。我們就目前應用干細胞治療脊髓損傷的研究現狀進行概述，并對其臨床應用前景進行展望。

1干細胞的種類及其相應特點

干細胞治療脊髓損傷的主要優勢包括①代替受損的神經細胞；②保護損傷脊髓中的內源性細胞，緩解殘存神經細胞的凋亡；③促進殘存神經元細胞軸突再生與突觸形成；④促進殘存和再生軸突的髓鞘形成；⑤減少膠質瘢痕的形成，提高移植干細胞的可塑性，并為內源性修復機制創造適宜的微環境。

目前可供選擇的干細胞包括iPS細胞（自體細胞）、胚胎干細胞（ESCs）、神經前體細胞（NPCs）、少突膠質前體細胞（OPCs）、Schwann細胞（SC）、嗅鞘細胞（OECs）、骨髓間充質干細胞（MSCs）、神經干細胞（NSCs）、多潛能干細胞（iPSCs）、臍血干細胞，以及皮膚、脂肪組織來源的干細胞等。

研究表明，脂肪、皮膚、黏膜組織來源的干細胞在體內外特定條件下可轉化成神經細胞，因其具有可自體移植、損傷性小、易于取材并且組織自我更新快等優點，使其成為自體移植修復脊髓損傷的理想細胞來源[3-6]。

另外，目前尚沒有確切的研究表明干細胞治療脊髓損傷的3種移植方式的療效差異和優劣。

1.1 胚胎干細胞

胚胎干細胞是從胚胎或新生幼體中分離出的干細胞，具有多向分化潛能，但一般只向特定的細胞系分化，最早用于治療脊髓損傷的研究。胚胎干細胞治療脊髓損傷主要通過誘導神經元和膠質細胞來替代受損神經細胞，修復脫髓鞘化軸突。另外，植入的胚胎干細胞還能改善損傷區域的微環境，提高神經細胞存活率。但是，有研究表明，胚胎干細胞的移植有致瘤性，并且臨床應用也面臨著醫學倫理及免疫排斥等關鍵阻礙[7]。

Yoo等[8]將可控表達細胞黏著分子L1的人胚胎干細胞植入脊髓損傷的小鼠中，結果顯示實驗組小鼠后肢運動功能評分（BMS）高于對照組。Baharvand等[9]利用視磺酸和堿性成纖維細胞生長因子作為誘導劑，將胚胎干細胞于三維膠原支架進行附壁培養、分化。超微結構分析可觀察到分化后的細胞具有典型的突觸結構。Yang等[10]在大鼠脊髓損傷模型中，將豬的胚胎干細胞和神經主細胞移植到損傷部位。結果顯示，在運動學功能評分（BBB）中實驗組得分明顯高于對照組，且觀察到后肢有明顯的功能恢復。

1.2 骨髓間充質干細胞

骨髓間充質干細胞是多功能分化干細胞，因其細胞具有分化為間葉組織細胞的能力而得名，是骨髓中的造血結構和功能性支持細胞。因為具有獨特的低免疫原性和免疫調節能力、易于擴增與保存、異體移植排斥反應小、捐獻簡單容易接受、可用于自體移植以及多器官歸巢效應等優勢，在脊髓損傷治療的相關研究中得到廣泛關注。雖然有相關報道顯示骨髓間充質干細胞可分化為神經細胞，但其在移植后能否形成功能性神經元還缺乏有力證據。

Nakajima等[11]將間充質干細胞移植入脊髓損傷模型后，能顯著上調L-13、L-4的表達，而TNF-α、IL-6表達明顯下降，從而改變了巨噬細胞表型，減少了瘢痕組織形成與軸突、髓磷脂的損失，提高了動物運動功能的恢復。Woodbury等[12]發現，骨髓間充質干細胞可在某些化學物質誘導下分化為神經元細胞。除了直接代替損傷的少突膠質細胞和神經細胞外，骨髓間充質干細胞還可通過釋放生長因子和細胞因子、促進血管生成、提供合適的生長基質、免疫調節和控制空洞形成等作用，對限制損傷擴大和促進再分化具有重要意義[13]。Penha等[14]運用狗的自體骨髓間充質干細胞治療自體脊髓損傷。移植10 d后，腱反射逐漸恢復，并出現微弱的淺、深痛覺反應。研究提示，骨髓間充質干細胞可能在脊髓損傷干細胞治療方面具有潛在的應用價值。

1.3 神經干細胞

神經干細胞屬于單能干細胞，存在于中樞神經系統中，能自我更新、復制，并向神經元、星形膠質和少突膠質細胞分化。動物實驗發現，體內移植的神經干細胞大多分化為星形膠質細胞，而并非神經元與少突膠質細胞，并且這種分化會引起劇烈疼痛[15]。因此，神經干細胞體內分化調控的技術是需要突破的重點。

Emgard等[16]將神經干細胞植入到脊髓損傷的大鼠中，發現宿主神經元與存活的細胞連接良好；BBB評分及網格步行與足印分析提示，大鼠后肢運動功能有明顯恢復。Medalha等[17]將神經干細胞移植到大鼠脊髓全斷模型中，觀察到神經干細胞可分化為神經元，或者接替受損的脊髓神經。但是，在較嚴重的脊髓損傷或完全脊髓損傷的治療中效果欠佳，胚胎脊髓的移植效果要明顯優于神經干細胞。研究表明，神經干細胞移植在較嚴重的脊髓損傷治療中的關鍵是細胞存活率和功能連接的形成方面。Gao等[18]將神經干細胞移植入膽堿能運動神經元缺陷的大鼠模型后，觀察到由神經干細胞分化的膽堿能神經元的軸突，能穿越腹側神經根和坐骨神經，并與外周肌肉組織形成神經-肌肉接頭，該動物的運動功能得到顯著改善。

1.4 誘導多潛能干細胞

Yamanaka等[19]將Oct4、Sox2、Klf4及c-Myc等4個基因通過逆轉錄病毒介導，轉入鼠成纖維母細胞，之后通過對轉染后細胞Fbx15的表達進行篩選，首次獲得具有干細胞功能的細胞，即誘導多功能干細胞。Okita等[20]隨后根據對Nanog的表達進行篩選，得到iPS細胞，其功能接近于胚胎干細胞，解決了醫學倫理學上的障礙，但是所植入的基因表達能力會減弱，且在宿主體內存活時間不長，病毒載體所導致的免疫排斥反應及可能的致瘤性還有待商榷[21-22]。之后，有研究將iPS細胞進行體外誘導分化，可得到理想的干細胞類型，從而避免了上述問題[23-26]。

Kimura等[25]將胚胎干細胞體外誘導成神經干細胞后，移植到小鼠損傷的神經細胞周圍，發現小鼠損傷神經纖維發生髓鞘化。Fujimoto等[27]的實驗觀察顯示，在免疫缺陷小鼠的脊髓損傷模型中，經iPS細胞治療后，小鼠運動功能有一定恢復。

1.5 臍血間充質干細胞

臍血間充質干細胞可分化為神經元及神經膠質細胞，且獲取容易，對供者無損害；可在體外進行增殖培養，在低溫凍存下可以長期存活并建立臍血干細胞庫；可在脊髓損傷中抗細胞凋亡、分泌多種神經營養因子，具有神經保護作用[28]。雖然臍血干細胞的應用不存在倫理學爭議，但在臨床應用上還是存在一些問題的。

Hu等[29]用超順磁納米顆粒（Superparamagnetic iron oxide nanoparticles，SPIO）標記的MRI顯示，人臍血干細胞能遷徙并能存活在大鼠脊髓損傷區域，進而促進大鼠神經功能的恢復。Park等[30]將臍血間充質干細胞移植到大鼠脊髓挫傷區域，術后1周內，每天給大鼠注射一次BrdU。大鼠的行為學分析表明，大鼠運動功能得到了明顯的恢復，且脊髓空洞體積更小，降低了細胞的凋亡。在實驗組，原位末端標記的細胞減少了，而BrdU標記的細胞明顯增多。研究顯示，在大鼠體內植入臍血多功能干細胞后，可縮小星形膠質細胞活化范圍，提高殘存軸突的存活，減少caspase-3與ED-1陽性細胞的數量[31]。

1.6 Schwann細胞

Schwann細胞分為有髓鞘和無髓鞘兩種，是構成周圍神經細胞的主要細胞，可傳導神經沖動，營養神經元，參與神經的生長和再生，分泌神經細胞外介質，介導抗原以及調節運動神經活性[32]。

夏雷等[33]把神經干細胞與Schwann細胞種植在共聚物支架上，移植到脊髓損傷的大鼠中，Schwann細胞可促進軸突再生及髓鞘化、促使神經干細胞向神經元樣細胞方向分化，且部分神經元樣細胞還可能形成了突觸連接。崔學文等[34]將外胚間充質源的Schwann細胞種植在纖維蛋白膠支架上，移植到脊髓損傷的大鼠中。細胞加支架組較對照組大鼠后肢運動能力有明顯恢復，單純支架組也有一定程度的恢復，但程度較低。另外，免疫組化染色顯示，細胞加支架組可見大量神經網絡狀結構。說明Schwann細胞對脊髓損傷后的組織學與功能恢復有明顯促進作用。Kanno等[35]在脊髓損傷的大鼠模型中植入基因修飾的可分泌神經營養蛋白和軟骨素酶的Schwann細胞，發現可促進大鼠神經軸突的再生并提高運動、感覺功能的恢復。

2 對于干細胞的特殊處理

除了iPS細胞外，在干細胞用于脊髓損傷治療之前，也可對其進行各種處理，以促進細胞治療的效果。

2.1 誘導細胞向神經元樣細胞分化

iPS細胞與胚胎干細胞存在著一定的致瘤風險，而骨髓間充質干細胞往神經元樣細胞分化的概率很小，如果在體外誘導上述細胞向神經元樣細胞分化，既消除了致瘤的可能性，又提高了細胞的修復功能。

高平等[36]采用了生物及化學兩種誘導方式，誘導骨髓間充質細胞分化為神經元樣細胞。實驗分4組，每組12只大鼠，采用脊髓半橫斷模型。建模后12周，生物誘導組大鼠運動功能持續恢復，顯著優于其他3組。脊髓組織切片HE染色顯示，化學誘導組與骨髓間充質干細胞組近似，神經元樣細胞崩解、膠質細胞增上、空洞形成少于DMEM培養液組，生物誘導組最佳。喻永濤等[37]將30只大鼠隨機分為實驗組與對照組，每組15只。體外培養臍血間充質干細胞并向神經元樣細胞方向誘導分化，用Hoechst標記后用于實驗組，而對照組注射PBS液。結果顯示，在脊髓病理切片中出現上述標記的移植細胞，5周后移植組功能恢復優于對照組。可見，誘導分化后的神經元樣細胞可以促進鼠脊髓損傷的功能修復。

2.2 干細胞聯合細胞因子促進脊髓損傷修復

張占修等[38]在脊髓損傷的大鼠的尾靜脈注射臍帶間充質干細胞，烏司他丁組腹腔注射。4周后觀察發現，大鼠下肢運動功能恢復優于單純的細胞移植組和單純的烏司他丁注射組；并且，PKH26標記的陽性細胞數量明顯多于其他組。實驗提示，聯合應用臍帶間充質干細胞和烏司他丁，可促進脊髓損傷大鼠神經突粗的再生，改善肢體電生理功能和運動功能。趙志軍等[39]研究自由基清除劑依達拉奉聯合神經干細胞移植對大鼠行為學的影響。實驗在8周后觀察到，PKH-26標記的神經干細胞在體內存活且在脊髓內遷移，可見少量連續性神經纖維通過損傷區，且熒光金逆行脊髓追蹤顯示，神經椎體細胞穿越了損傷區，且后肢運動功能BBB評分最高。實驗說明，依達拉奉能促進干細胞在損傷區的存活并向神經細胞分化，且聯合移植臍帶間充質干細胞可顯著提高大鼠脊髓損傷的修復效果。

2.3 兩種細胞共移植

不同干細胞種類各具優勢，比如神經干細胞能有效分化為神經元樣細胞，而骨髓間充質干細胞能有效緩解炎癥環境。如果將兩種細胞共同移植到脊髓損傷區域，將可能產生協同作用，并更加有效地修復脊髓損傷。

Luo等[40]研究神經干細胞與嗅鞘細胞的共移植，在感覺功能提高上的效果及潛在的分子機制。在熱痛閾和機械痛閾的測量中，神經干細胞恢復了脊髓損傷大鼠的感覺功能，而嗅鞘細胞則可引起痛覺過敏。共移植可促進神經干細胞的存活，逆轉嗅鞘細胞引起的痛覺過敏，這對神經感覺功能的恢復起到很大作用。同時，實驗還發現，在共移植組的大鼠中，神經生長因子的表達大幅下調。推測這兩種細胞的共移植在脊髓損傷修復中的可能機制為下調神經生長因子的表達。葉超群等[41]實驗探討嗅鞘細胞與Schwann細胞的共移植對大鼠脊髓損傷修復的影響。結果顯示，5~8周后，實驗組BBB評分較對照組高，9、10周時兩組無明顯差異。造模后10周，實驗組大鼠脊髓損傷部分瘢痕及損傷范圍較小。說明兩種細胞的共移植在一定程度上促進了大鼠損傷脊髓的恢復，但未能促進大鼠后肢運動功能的提高。

2.4 干細胞基因轉染后移植

某些生長因子或蛋白類的物質能緩和炎癥環境，提高移植細胞的生存率，增加干細胞定向分化的機率，從而提高脊髓損傷的修復效率高。因此，將目的基因轉染到移植的干細胞內，使其持續產生相應蛋白，這就使損傷脊髓的修復達到更好的效果。

研究表明，通過慢病毒介導的神經營養因子-3穩定轉染大鼠骨髓間充質干細胞，轉染率可達到60%~70%，并且目的基因和神經營養因子-3蛋白的表達可以被檢測到，從而為干細胞治療脊髓損傷提供了一種新的方式[42]。Kumagai等[43]于大鼠脊髓損傷7 d后，在損傷中心分別植入PBS（對照組）、GFP標記的骨髓間充質干細胞、用GFP標記修飾后表達MNTS1的骨髓間充質干細胞，以及用GFP修飾后表達MNTS1/P75-的細胞。實驗觀察顯示，與對照組相比，所有的移植組炎癥反應都有緩解，并且囊性空腔都相對縮小。而且，基因修飾的兩實驗組軸突生長明顯提高、皮膚過敏反應顯著改善。另外，MNTS1/P75-組中移植物促進了血管生成，且改善了膠原瘢痕。

3 干細胞治療脊髓損傷的研究及臨床應用現狀

3.1 干細胞治療在動物實驗中的效果

干細胞被用于多種動物的脊髓損傷修復實驗中，從目前的實驗結果來看，動物后肢的運動功能及感覺能得到一定程度的恢復，療效滿意。Li等[44]使用復合表皮生長因子受體抗體的功能化膠原支架，促進神經前體細胞的神經分化，來修復大鼠脊髓損傷。在體外實驗中觀察到，對于暴露于髓磷脂蛋白質的神經前體細胞，采用1 μg西妥昔單抗附合的膠原支架，能促進向神經元方向的分化，并抑制向星形膠質細胞方向的分化。體內實驗中，將表達綠色熒光蛋白的神經前體細胞嵌入的支架，移植到4 mm長的大鼠半切損傷區域，發現復合5 μg西妥昔單抗的膠原支架，誘導了神經前體細胞向神經元方向分化，減少了向星型膠質細胞方向的分化，促進了軸突的再生，明顯提高了神經功能的恢復。Iwasaki等[45]將自組裝肽與神經干細胞，通過直接注射的方式，植入大鼠頸部脊髓損傷模型，發現能協同促進組織與前臂功能的恢復。Himes等[46]將骨髓干細胞通過靜脈注射的方式，植入脊髓損傷的小鼠體內，小鼠BBB評分2周后明顯提高，行走功能及溫度覺顯著恢復。

3.2 干細胞的臨床研究現狀

干細胞治療脊髓損傷具有獨特的優點，但臨床使用還存在著未知風險和尚未解決的技術問題。因此，干細胞的臨床治療還需要進一步深入探索。Dai等[47]將患者自身的骨髓間充質干細胞移植到完全性、慢性的頸段脊髓損傷部位，40例患者中，實驗組患者的功能相比對照組明顯恢復，且在觀察的6個月中無腫瘤發生跡象。李志營等[48]對78例脊髓損傷患者行自體脊髓間充質干細胞與自體腓腸神經聯合移植的方法進行治療研究，結果顯示具有一定的療效，證實了自體脊髓間充質干細胞與周圍神經共移植治療脊髓損傷的方法安全有效。Yazdani等[49]用自體Schwann細胞與骨髓間充質干細胞聯合移植，治療慢性脊髓損傷，并對安全性與可行性結果進行評價。共8名完全性創傷性脊髓損傷患者參與了該研究，平均隨訪2年。MRI顯示，所有患者并沒有瘤性組織增生、脊髓空洞癥等跡象，同樣也沒有出現感覺和運動功能的退化。3名患者ASIA感覺量表評分有輕微提高，但ASIA等級沒有改變，同時運動分數沒有提高。患者普遍主觀感覺有所改善，比如排尿與排便的感覺提高、坐姿更加穩定以及軀體的平衡能力得到改善。雖然兩種細胞的聯合移植治療無明顯效果，但其安全性得到了證實。Liu等[50]將臍血間充質干細胞通過鞘內注射的方式注入22名患者體內，每周1次，4次為1個療程。其中，4例患者接受了2個療程治療，1例患者接受了3個療程的治療，其他患者為1個療程。結果顯示，通過注射方式進行臍血干細胞植入的方法是安全的，能夠提高大部分非完全性脊髓損傷患者的神經功能和生活質量。

4 總結

干細胞治療不論在動物實驗，還是臨床試驗方面，都顯示了在脊髓損傷修復治療上的優勢及前景。但脊髓損傷修復是多學科參與的工程，單靠干細胞移植不能解決所有與脊髓損傷治療有關的問題，所以與早期手術治療、新的藥物治療、康復手段、物理輔助、營養調理、相關分子或受體阻斷物結合的治療策略顯得尤為重要，是將來研究的方向。

雖然干細胞在治療脊髓損傷的研究中，有許多問題尚未解決，部分細胞移植存在倫理學爭議和致瘤性風險，但是目前的研究成果已經揭示了其臨床應用前景是廣闊的。

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Stem Cells and the Repair of Spinal Cord Injury

HAN Qianqian1,XU Yan2,WANG Hong2,HUANG Jingchun3.

1 Department of Biomaterials and Tissue Engineering,Institute of Medical Device Verification,the National Institutes for Food and Drug Control,Beijing 100050,China;
2 Department of Orthopedics,First Hospital of Dalian Medical University,Dalian 116044,China;
3 SFDA-Jinan Quality Supervision and Inspection Center for Medical Devices,Jinan 250100,China. Corresponding author:WANG Hong(E-mail:768852847@qq.com);HUANG Jingchun(E-mail:sdzxhuangjc@163.com).

【Summary】Spinal cord injury is still a disease which is hard to cure in clinic and a project under research.The operation treatment and corresponding auxiliary treatment did not achieve a satisfied result.The cell-therapy of stem cells transplants to the patients'spinal cord injury area is a promising method.By the replacement of damaged cells,reducing the formation of glial scar,promoting the survival of neurons axonal regeneration and the synapse's formation,stem cell promote the recovery of function and morphology.In thispaper,the application of stem cell therapy in treating spinal cord injury was reviewed and prospected.

Spinal cord injury;Stem cell;Tissue engineering

R683.2

B

1673－0364（2015）04－0269－05

10.3969/j.issn.1673-0364.2015.04.014

2015年5月20日；

2015年6月17日）

中科院先導計劃課題（XDA01030504，XDA01030503）；863課題（2012AA020507）；國家自然科學基金（81271719，81341060）。

100050北京市中國食品藥品檢定研究院醫療器械檢定所生物材料和組織工程室（韓倩倩）；116044大連市大連醫科大學第一附屬醫院骨科（許琰，王宏）；250101濟南市山東省醫療器械產品質量檢驗中心（黃經春）。

王宏（E-mail：768852847@qq.com）；黃經春（E-mail：sdzxhuangjc@163.com）。

注：韓倩倩，許琰為共同第一作者。