不同分化階段多能干細胞移植實驗研究進展

李 君 杜 瀟 周曉囡 吳嫣爽 雷 蕾

·綜述·

不同分化階段多能干細胞移植實驗研究進展

李 君 杜 瀟 周曉囡 吳嫣爽 雷 蕾

誘導多能干細胞是由動物體細胞重編程得到的，具有胚胎干細胞特性的全能干細胞。近年來，隨著多能干細胞誘導技術的不斷優化，以及體外分化技術的飛速發展，多種分化狀態的多能干細胞被用于移植實驗。我們結合最新研究進展，闡述各種分化階段iPS細胞用于動物移植治療的優缺點，以及最新移植方法所存在的問題。

誘導多能干細胞囊胚互補器官芽

胚胎干細胞是從動物早期胚胎內細胞團中分離出來的一類具有無限增殖、自我更新和多向分化特性的細胞，在細胞治療、組織再生以及器官修復等諸多方面有著廣泛的應用前景。但是，胚胎干細胞的研究與應用存在嚴重的倫理問題。2006年，Yamanaka等[1]通過在小鼠成纖維細胞內過表達oct4、sox2、klf4、c-myc四種轉錄因子，得到一種在形態功能上類似于胚胎干細胞的細胞，稱為誘導多能干細胞（Induced pluripotent stem cells，iPSC）。2007年，Thomson等[2]利用oct4、sox2、nanog、lin28四種轉錄因子的組合，成功獲得人類iPS細胞。由于iPS細胞源于患者自身體細胞，不存在免疫排斥問題及倫理限制。隨著近年來干細胞體外分化技術的成熟和發展，經過體外誘導的各種分化細胞被用于移植實驗，我們以多能干細胞分化狀態為線索，闡述近年來干細胞移植實驗的新思路，以及最新的研究進展。

1 誘導多能干細胞移植

1.1 誘導多能干細胞動物體內移植

iPS細胞是一種多能細胞，可以分化為動物體內所有類型的細胞，理論上來說可以用于修復所有器官的損傷。2009年，Nelson等[3]利用逆轉錄病毒的方法導入經典四因子，將人皮膚成纖維細胞重編程為iPS細胞，并移植入心肌梗死模型的免疫缺陷小鼠梗死灶內，3周左右進行B超檢測，梗死部位心室壁有所增厚，但在移植部位發現了人源性腫瘤。為了避免再次出現腫瘤，實驗小組將受體小鼠改為免疫功能正常的小鼠，并且降低細胞注射量，發現在心肌梗死灶內注射2×105個細胞不僅能夠使細胞穩定存在8周以上，并且沒有腫瘤形成。移植后的小鼠心室壁梗死部位有所增厚且射血分數增高。免疫組化顯示，植入細胞表達人心肌表面標記，說明iPS細胞分化為心肌細胞，從而對損傷心臟起修復作用。有研究將豬的iPS細胞注入慢性心肌缺血、免疫功能正常的豬體內，經過3個月的體內分化，移植細胞轉變為豬心肌細胞，并且有效緩解心肌缺血癥狀[4]。

iPS細胞用于細胞治療，其成瘤問題不可忽視。多項研究證實，iPS細胞用于移植實驗的成瘤風險高于ES細胞。由于早期iPS細胞的制備過程中采用的是逆轉錄病毒載體，可能引起病毒基因組與細胞基因組的整合，從而增加成瘤風險。2013年，Fink等[5]利用腺病毒載體的方法（腺病毒載體基因不整合進入細胞基因組）得到大鼠iPS細胞，并且將4×105個細胞注入大鼠紋狀體內，90 d后切片觀察，無腫瘤形成且所注射細胞表達成熟的神經細胞表面標記。Liu等[6]將人類多種組織來源的體細胞利用附加型載體（一種不會引起基因整合的載體）獲得iPS細胞，通過尾靜脈注入肝硬化模型的免疫缺陷鼠體內，移植后8周在小鼠外周血內檢測到少量人白蛋白，注射細胞組相對于對照組小鼠存活率明顯提高。此實驗中，細胞注射量高達2×106，但在小鼠體內并未發現腫瘤。無基因重組的誘導方法大大降低了iPS細胞的成瘤風險。隨著iPS誘導技術的不斷發展，已經能夠穩定且高效地制備出不存在基因整合的高質量iPS細胞，將此類細胞注入特定的損傷微環境內，將促進其向相應的細胞類型分化，從而修復損傷。

1.2 誘導多能干細胞囊胚內移植

近年來，干細胞療法所面對的疾病一般都是通過細胞替代就可以治愈的疾病，比如帕金森氏病、糖尿病等，但再生醫學的最終目的是通過患者自身的多能干細胞培育出正常器官，用于器官移植來代替病變器官。

Chen等[7]將野生型小鼠ES細胞植入rag2基因敲除小鼠（小鼠rag2基因缺失不能產生成熟T、B淋巴細胞）囊胚內，得到表型正常的嵌合體后代，其體內T、B淋巴細胞幾乎全部來自于所注入的ES細胞。通過向發育缺陷囊胚內移植正常干細胞來修復發育障礙，以獲得正常表型后代的方法稱作囊胚互補。2010年，Kobayashi等[8]將小鼠成纖維細胞來源的iPS細胞植入PDX1-/-（PDX1基因缺失動物胰腺發育不全）大鼠囊胚內，出生的后代表型正常，但胰腺幾乎全部由小鼠細胞發育而來，借此完成首例異種間囊胚互補實驗。此實驗進一步證明，存在發育缺陷的囊胚微環境會刺激外源性正常干細胞向該囊胚內急需的細胞類型分化，以產生正常表型的嵌合體后代。這種異種間嵌合體的出現，使囊胚互補技術應用于臨床成為了可能。

2013年，Matsunari等[9]利用PDX1基因敲除的成纖維細胞核作為供體，通過二次核移植，得到PDX1-/-胚胎，并在體外培養到桑葚胚階段，向此胰腺發育不全的桑葚胚內注射帶有熒光標記的正常豬胚胎干細胞，然后將嵌合體胚胎植入代孕母豬體內，出生的小豬表型正常，胰腺細胞幾乎全部帶有熒光標記，首次在大動物身上成功完成了囊胚互補實驗。

實驗過程中構建了一個發育缺陷的豬囊胚，若將注入的細胞改為人類的iPS細胞，能否像大小鼠間產生胰腺一樣跨越種間屏障而得到人類嵌合體器官呢？如果通過囊胚互補技術得到了人類器官，雖然器官內會有少量豬細胞嵌合，但由于所得器官絕大部分由患者iPS細胞發育而來，將不會引起過于強烈的排斥反應。α1，3-半乳糖苷酶基因敲除豬[10]（α1，3-半乳糖苷酶是引起異種間器官移植超急性免疫排斥反應的主要抗原）的出現，使目的器官內少量豬細胞引起的輕微免疫排斥反應更加微不足道。

利用囊胚互補原理，將iPS細胞向胚胎內移植是近年來才出現的方法，由于細胞移植發生在動物建立免疫耐受的胚胎階段，該方法巧妙地避開了免疫排斥反應，但還需要進一步的研究和完善。

2 誘導多能干細胞體外分化后移植

2.1 多能干細胞誘導分化為功能細胞進行移植

隨著對胚胎發育分子機制了解的深入，已經能夠通過各種小分子模擬胚胎干細胞在體內的分化過程，將多能干細胞在體外誘導為有功能的分化細胞，再植入動物體內進行研究。

Ⅰ型糖尿病是由于自身免疫系統攻擊胰島B細胞而導致的胰島素分泌障礙，患者必須每天注射胰島素，否則將危及生命。2012年，Bellin等[11]將人類異體胰島移植入Ⅰ型糖尿病患者體內，患者5年內不需要注射胰島素。由于植入的是異體胰島，所以需要同時服用免疫抑制劑以降低免疫排斥反應。2014年，Hrvatin等[12]在體外模擬胰島細胞的分化過程，將人iPS細胞誘導為定型內胚層細胞，再誘導為胰島前體細胞，最后通過小分子的刺激，得到表達胰島B細胞表面標記（INS+）的細胞。這種細胞在體內外均可分泌少量胰島素，但不會因為外周葡萄糖濃度的改變而改變胰島素的分泌量，并不具備血糖敏感性，因此不能用于細胞治療。全基因表達譜分析，這種細胞與人類胎兒胰島B細胞更相近，并不是具有血糖調節功能的成年胰島細胞。同年，Pagliuca等[13]優化胰島前體細胞成熟步驟，從70多種小分子化合物，150多種組合中挑選出一組能夠高效誘導胰島前體細胞成熟的分子組合。所得到的細胞命名為SC-b細胞（stem-cell-derived b cells）。將SC-b細胞移植入免疫缺陷鼠腎被膜下，2周后可在外周血內檢測到人胰島素分泌，給予小鼠不同濃度的葡萄糖刺激，小鼠外周血內人類胰島素分泌量與其血糖濃度呈正相關。患者自身體細胞來源的SC-b細胞理論上來說是一類不存在免疫排斥反應，且具有血糖敏感性的胰島素分泌細胞，完全可以替代自身受損的胰島B細胞完成胰島素分泌功能。通過體外誘導得到的SC-b細胞雖然與正常胰島B細胞存在一些基因表達以及表觀修飾上的差異，但也屬于一種自身胰島B細胞，移植入患者體內可能會遭到自身免疫系統的攻擊而導致功能喪失。因此，SC-b細胞目前還不能應用于臨床治療。

終末期肝臟疾病的患者可以通過移植大量正常肝細胞來進行治療，但是由于可供移植的肝臟細胞來源有限且很難在體外進行擴增培養，所以尋找合適的肝細胞源成為肝細胞移植的首要問題。2010年，Si-Tayeb等[14]將人iPS細胞誘導為定型內胚層細胞，再誘導為肝臟祖細胞，最后通過幾種小分子促進肝臟祖細胞轉變為成熟肝細胞。Liu等[6]將這種方法得到的人類肝臟細胞，通過尾靜脈注入肝硬化模型的免疫缺陷鼠體內（2×106個/只），明顯提高了模型小鼠的存活率（注射細胞組8周存活率85%左右；對照組8周存活率40%左右）。細胞注射8周后處死，在小鼠肝臟內檢測到12%左右的人類成熟肝臟細胞嵌合。說明所注入的人類誘導肝細胞不僅能夠正常分泌人白蛋白（ALB），還可嵌合在受體肝實質內穩定存在。

隨著干細胞分化技術的成熟，類似的實驗不勝枚舉。比如將人iPS細胞在體外誘導為多巴胺能神經細胞，注入大鼠腦內治療帕金森氏病[15]；把人iPS細胞誘導為造血干細胞治療小鼠鐮刀狀細胞貧血癥[16]等。

2.2 誘導多能干細胞為微器官進行移植

上述的細胞移植實驗，一類是靜脈注射細胞懸液，利用細胞趨向性定植在目的位點；一類是原位移植細胞團塊。前者會使移植細胞隨血流在體內散狀分布，引發不可控的后果。后者移植的細胞團塊可由于黏附不牢而脫落，亦或隨著細胞增殖，團塊內部營養不良導致壞死而引起一系列的不良反應。

正常肝臟在發生過程中形成“肝膨大”，與此同時，間質細胞與血管內皮祖細胞立即在“肝膨大”內形成網狀分布的血管。Takebe等[17]為了模擬這一過程，將人iPS分化來的肝祖細胞、人臍靜脈內皮細胞、人類間充質干細胞共培養于一個培養皿內，48 h后，培養皿內混合細胞自發組裝成一個含有血管的三維團塊——“肝芽”。全基因表達譜分析，此“肝芽”類似于人類3~4周的胎肝，并不具備成熟肝臟的功能。由于血流動力學的刺激有利于肝臟的成熟，實驗組又將“肝芽”移植入免疫缺陷鼠顱腔內，48 h左右宿主血管開始與“肝芽”內血管相融合，進行營養供應，并在第6天左右開始分泌人血清白蛋白，行使成熟肝臟功能。移植“肝芽”雖然不能像移植成熟肝臟細胞一樣迅速發揮功能，但其成熟后所分泌人ALB的量和持續時間，是遠遠超過直接移植成熟肝臟細胞的。這種源于患者自身體細胞的“器官芽”不僅不存在免疫排斥反應，而且還具有“扎根”和“成長”的能力，用于移植治療的效果必然遠優于單純的功能細胞移植。

隨著體外“肝芽”組織的誘導成功，人們開始嘗試在體外誘導其他器官。2013年，Huang等[18]將人類ES/iPS細胞在體外誘導為肺祖細胞，將未經純化的NKX2.1+FOXA2+細胞植入小鼠腎被膜下，6個月后切片觀察，移入的細胞自發分化為含有肺泡、支氣管、平滑肌、軟骨等所有結構的微型肺臟。同年，Takasato等[19]將體外誘導來的人腎祖細胞與12.5~13.5 d的胎鼠腎臟細胞懸液共培養4 d，得到人類細胞組裝在腎小球部位的嵌合體腎單位。McCracken等[20]利用人類干細胞在體外培養出具有腺體結構且能夠容納腸道細菌的“微型胃”。這些結果說明，在特定條件下將早期支持細胞與功能性祖細胞共培養，會趨向于形成正常結構的“器官芽”，可直接用于移植治療或植入受體促其成熟后再用于移植。

3 展望

iPSC的出現，可以得到具有多向分化能力的全能細胞，避免了免疫排斥和倫理問題。隨著干細胞體外誘導技術的飛速發展，人們已經可以將干細胞誘導為人體大部分類型的細胞。2014年9月，成功地將老年性黃斑變性患者皮膚來源的iPS細胞誘導為視網膜色素上皮細胞薄層，替換其受損視網膜，完成了世界上首例iPS細胞治療，并獲得滿意療效。

但相關技術中存在的問題是不可忽視的，比如“囊胚互補”所得器官內的異種細胞嵌合如何解決？結構不規則的“器官芽”怎樣與患者組織相吻合？芽體成熟后能否感知患者體內信號變化，并發揮相關功能等問題，還需進一步探索解決。

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Transplantation Studies of Pluripotent Stem Cells at Different Differentiated Stages

LI Jun,DU Xiao,ZHOUXiaonan,WU Yanshuang,LEI Lei.
Department of Histology and Embryology,Harbin Medical University,Harbin 150081, China.Corresponding author:LEI Lei(E-mail:leiys2002@yahoo.com).

【Summary】Induced pluripotent stem cells(iPSCs)derived from reprogrammed somatic cells,are totipotential cells similar to embryonic stem cells.Recently,iPSCs inducing technology has been promptly improved in methods of induction and differentiation in vitro.Consequently,iPSCs at different differentiated stages have been widely used in cell transplantation experiments.Here,the current researches of iPSCs transplantation were summarized,some novel methods comparing with the older one and some problems need to be resolved before iPSCs could be applied in clinic therapy were all reviewed.

Induced pluripotent stem cells;Blastocyst complementation;Organ bud

Q813.1

B

1673－0364（2015）04－0266－03

10.3969/j.issn.1673-0364.2015.04.013

2015年5月19日；

2015年7月8日）

國家973項目（2012CBA01303）。

150081黑龍江省哈爾濱市哈爾濱醫科大學組織學與胚胎學教研室。

雷蕾（E-mail：leiys2002@yahoo.com）。