microRNA參與急性腎損傷的研究進展

·綜述·

microRNA參與急性腎損傷的研究進展

吳聲丁小強方藝

Research Development of MicroRNA Involving in Acute Kidney InjuryWUShengDINGXiaoqiangFANGYi

DepartmentofNephrology,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China

急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是一種涉及多學科的臨床常見危重病癥。AKI的發病率在綜合性醫院為5%～15%，在重癥監護病房則達30%～60%[1-3]。2004—2008年176 155例住院患者的流行病學研究數據[4]顯示，住院患者AKI發病率為3.19%，病死率為19.68%，經校正后AKI患者對所有患者住院病死率的比值比(OR)為9.86。盡管近年來血液凈化技術已有長足進步，但AKI患者的死亡率仍居高不下，重要原因之一是缺乏有效的早期診斷和防治手段。目前臨床上常用的腎功能指標，例如血清尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)和肌酐(creatinine, Cr)等在腎臟損傷早期缺乏敏感性和特異性。因此，目前AKI防治的基礎研究主要集中于：(1)尋找新的、更為敏感的早期診斷的新標志物；(2)探索AKI治療的分子靶點和特異信號途徑。近年來研究證實，微小RNA(microRNA, miRNA)廣泛參與細胞增生、凋亡、免疫炎性反應等多種機體生物學過程的調控，在AKI的發病中也起著至關重要的作用。

1miRNA概述

miRNA是一類由21～ 25個核苷酸組成的內源性非蛋白質編碼的RNA序列，它們參與的基因調控是遺傳程序中最基本的一步。miRNA能在轉錄后水平調控基因的表達，其通過與靶基因 mRNAs 的3′非翻譯區(untranslating region，UTR)完全或不完全互補結合，降解靶基因mRNAs或抑制其翻譯，從而有效抑制相關蛋白的合成[5-6]。人類編碼蛋白的基因中至少有1/3受到 miRNA的調控；而在單個基因的3′UTR中也發現能與多個 miRNAs互補的位點，提示miRNA組合調控模式十分復雜。miRNA既扮演著“管理員”的角色，使生命活動有條不紊地進行，又是決定某些關鍵事件的分子開關，并能有效沉默機體所不需要的靶基因，廣泛涉及細胞的分化、增殖、代謝和凋亡等。miRNA在個體發育和一些疾病尤其是腫瘤發生中的作用越來越受到關注，并已成為治療研究的重要靶點。miRNA在腎臟中作用的報道始于2004年。之后的多項研究表明，miRNA在腎臟的發育及生理、病理過程中也起了重要作用。

miRNA的成熟過程包括若干步驟。首先，miRNA基因翻譯后的初級產物——pri-miRNA在細胞核內經核糖核酸酶Drosha加工，形成具有莖-環結構的pre-miRNA；然后，pre-miRNA進入胞質，被Dicer酶加工成雙鏈RNA(miRNA：miRNA*)，其中一條鏈被降解，而另一條鏈則與RNA誘導沉默體(RISC)相整合后進行靶基因調控[7-8]。

隨著對miRNA研究的深入，學者們發現，miRNA不僅能穩定地在組織或細胞中表達，同時也能以一種穩定的、游離的狀態存在于各種體液中，包括尿液、血液、唾液和乳汁等。這類游離的miRNA的來源和存在形式目前尚未明了，但是一般認為有三種可能：(1)來自組織損傷，當細胞發生凋亡或壞死時，細胞結構破壞，導致細胞內的miRNA被動釋放；(2)來自微泡(microvesicle，MV)的主動分泌，微泡是正常或病理的情況下各類細胞釋放出的膜封閉的細胞碎片，如外泌體和囊泡；(3)miRNA 結合蛋白途徑，循環中的miRNAs可以與HDL(high-density lipoprotein)，AGO-2(argonaute-2)，NPM-1(nucleophosmin-1)蛋白相結合，從而不被RNA酶降解。此外，盡管miRNA的分子量很小，但在透析時不會被透析膜清除，這也證實了miRNA在血液中與大分子物質相結合且穩定存在[9]。因此，miRNAs可能因其易獲得性和穩定性而成為一種潛在的AKI防治靶點或早期診斷的生物標志物。

2miRNA與腎臟缺血再灌注損傷(ischemic reperfusion injury, IRI)的關系

IRI是AKI發生的重要機制。Dicer在miRNA成熟過程中起重要作用。研究[10]通過敲除C57BL/6小鼠腎臟近曲小管上皮細胞的Dicer基因(PT Dicer-/-)，探究腎小管上皮細胞miRNA與IRI的關系。結果表明，小鼠近曲小管上皮細胞PT Dicer-/-不影響腎臟的發育和生理功能，然而發生雙側腎臟IRI后，與對照組相比，PT Dicer-/-小鼠更耐受IRI，腎臟病理損傷程度輕，存活率更高。同時，該研究比較了兩組小鼠腎皮質miRNAs的表達豐度， miRNA微陣列芯片分析結果顯示，標記的173種miRNAs中有139種(80.3%)的表達豐度在PT Dicer-/-組顯著下調，包括在正常腎組織富集的miR-192、miR-194以及在多種臟器中高表達的miR-16，提示miRNA參與IRI過程。隨后，Godwin等[11]在單側腎臟IRI小鼠模型中發現，缺血腎組織中有9種miRNAs(miR-21、miR-20a、miR-146a、miR-199a-3p、miR-214、miR-192、miR-187、miR-805、miR-194)的表達豐度發生顯著變化。其中，miR-21和miR-20a在缺血再灌注后立即上調；miR-146a、miR-199a-3p、miR-214在缺血再灌注3 d后上調，其中前兩者的表達豐度在觀察期間保持上調，而miR-214則在缺血再灌注第21天開始衰減；miR-192和miR-187 在對照組中較基線值表達上調并保持平穩，而在IRI組中豐度持續下降；IRI組小鼠腎組織的miR-805 和miR-194的表達豐度雖然下降，但與對照組的表達趨勢相似。Godwin等同時對NK細胞、T淋巴細胞和B淋巴細胞功能缺失的R0/cg0雙基因敲除小鼠施以相同的缺血再灌注打擊，所獲得的腎臟miRNA的指紋圖譜與野生型小鼠相似。由此證明，缺血再灌注時miRNA的這些變化與免疫炎性反應無關，是IRI特有的指紋圖譜。

有多項研究報道了單個miRNA在腎損傷過程中的作用。研究[12]發現，miR-494的靶基因之一是激活轉錄因子-3(activating transcription factor-3，ATF-3)；上調miR-494可抑制ATF-3表達，進而通過NF-κB途徑調節炎性因子和黏附分子的釋放，促進炎性反應，從而加重IRI。該研究還發現，盡管血漿miR-494水平與AKI發病無關，但是尿液miR-494豐度與AKI的發生呈正相關，且尿液miR-494的表達變化早于血肌酐變化。

低氧誘導因子(hypoxia inducible factor，HIF) 在腎臟對缺血/缺氧的反應調節中起重要作用。作為維持氧自穩平衡的核心調控因子，HIF調控多種低氧應答基因的表達。這些基因產物或能增加缺氧組織的氧供和氧運輸能力，或能降低細胞耗氧量，從而緩解氧供需失衡，維持內環境的穩定，使機體對缺血缺氧耐受和適應。Aguado-Fraile等[13]研究發現，低氧刺激誘導HIF-1α上調后，miR-127的表達上調；而體外細胞實驗證實，過表達miR-127可改善近曲小管上皮細胞由低氧刺激所致的骨架結構和細胞黏附功能的異常，表現為黏著斑復合物(focal adhesion complexes，FAC)分解、緊密連接破壞以及肌動蛋白解聚等現象被逆轉。已證實miR-127的靶基因是驅動蛋白家族成員3B(kinesin family member 3B，KIF3B)，后者參與腎小管上皮細胞內吞和微管轉運運輸，且其表達與miR-127的表達呈負相關。miR-127上調能通過下調KIF3B而介導離子轉運的正確定位，減少近曲小管細胞的內吞，減少能量損耗，起到對腎組織的保護作用。由此可見，miR-127在腎損傷中起重要作用，也可以作為AKI潛在的生物學標志物和治療靶點。

3miRNA與腎毒性物質所致AKI的關系

藥物是導致AKI的重要因素之一，包括氨基糖苷類氨基酸和抗腫瘤藥物等。順鉑是治療腫瘤最常見和最有效的藥物之一，其主要的不良反應是腎毒性，發生率為25%～35%。順鉑通過ATR-Chk2信號途徑激活p53，進而破壞腎小管上皮細胞的DNA結構，導致細胞損傷和死亡。然而，p53的作用具有兩面性，它既參與腎小管上皮細胞損傷，也可以通過上調miR-34a發揮一定的腎臟保護作用。體內外實驗[14]證實，順鉑可以誘導腎小管上皮細胞miR-34a水平上調，而在應用p53抑制劑或在p53基因敲除的小鼠模型中，順鉑對miR-34a的上調作用消失，可見p53介導了順鉑誘導的miR-34a表達上調；另一方面，采用anti-miR-34a抑制腎小管上皮細胞中的miR-34a表達可促進細胞凋亡，反之，促進miR-34a過表達可減少細胞壞死、增加細胞活力，提示miR-34a在順鉑誘導的AKI中起保護作用。

4miRNAs與缺血預適應的關系

缺血/缺氧引起器官損傷取決于兩個方面，即缺血/缺氧的程度和器官對缺血/缺氧的耐受程度。如果器官對缺血/缺氧耐受，則不會發生損傷或損傷的程度較輕。短時間的缺血預處理能顯著減輕器官后續嚴重缺血引起的損傷，這種機體的自我保護現象稱為缺血耐受或缺血預適應(ischemic preconditioning, IPC)，是迄今為止發現的最強有力的預防缺血性器官損傷的內源性措施。IPC最早是在有關心和腦的研究中被提出，之后的研究(包括我們科室近十余年的研究)均證實腎臟IPC可以減輕二次缺血打擊對腎臟的損傷。因此，誘導缺血/缺氧耐受可有效防治急性缺血性腎損傷。

我們的研究[15]證明，15 min的腎臟缺血處理可以使腎臟耐受后續的缺血打擊，并減輕IRI的程度；預缺血的腎保護作用與腎組織miR-21的表達上調相關，而miR-21的上調可抑制程序性細胞凋亡因子4(programmed cell death protein 4,PDCD-4)的表達，減少細胞死亡，進而預防或減輕腎臟缺血損傷程度。而miR-21的上調依賴于HIF-1α的表達上調，如采用HIF-1α decoy技術抑制HIF表達，則可抑制miR-21的表達。在成功建立腎臟缺血預實驗動物模型的基礎上，我們還建立了不同策略誘導的腎臟缺血/缺氧耐受模型。我們近期的研究[16]發現，氙氣預處理也可保護對IRI的保護作用腎臟。經氙氣預處理過的小鼠在遭受缺血刺激時，腎小管細胞的損傷減輕；同時發現，氙氣預處理后，miR-21表達上調，如采用anti-miR-21抑制腎組織miR-21表達，則氙氣的保護作用減弱，提示miR-21在氙氣預處理IRI中起著重要作用。此外，我們在氨基糖苷類誘導的腎毒性動物模型中也證實，氙氣預處理通過上調miR-21豐度而減輕腎毒性[17]。可見，無論是在預缺血處理還是氙氣誘導的缺氧耐受中，miR-21都發揮了關鍵的作用。

5分泌型miRNA

分泌型miRNA以微泡形式或與蛋白質結合的形式穩定存在于體液中。與其他以游離形式存在的miRNA最主要的區別在于，分泌型miRNA是細胞主動耗能分泌的。它可以作為細胞間聯系的一種重要分子，廣泛存在于各種細胞內，其生物學作用不受細胞間距離的影響，且供者細胞分泌的miRNA能夠影響受者細胞的基因表達[18]。

由內皮干細胞(EPC)主動分泌的富含miRNA的微泡在缺血再灌注時能保護受損器官，減輕IRI。德國學者Cantaluppi等[19]采用微陣列技術對EPC和EPC分泌微泡進行了分析，發現有131種miRNA為兩者共有，另有26種miRNA僅富集于微泡中，其中包括促進血管新生的miR-126和抑制凋亡的miR-296。在體內試驗中，將從外周血EPC中分離的微泡從尾靜脈及時注入發生缺血損傷的大鼠體內后可以促進腎小管上皮細胞增生，減少上皮細胞凋亡，減少白細胞浸潤；而用RNase處理、敲除Dicer基因或用anti-miR-126﹑anti-miR-296處理EPC后，這種保護作用消失。因此認為，分泌型miRNA對AKI起保護作用。

分泌型miRNA不僅可以在AKI中起保護作用，而且因其具有結構穩定、不易受尿液因素影響、變化出現早、可無創性獲得等優點，還可以作為AKI的特異性生物標志物。miR-21不僅在腎組織中條件性高表達，而且當腎臟遭遇缺血損傷時，其在體液(尿液和血液)中呈時序性變化。臨床研究[20]顯示，血漿和尿液中的miR-21的豐度與心臟術后AKI的進展程度及患者預后相關，因此，miR-21可能作為AKI早期診斷和預后預測的新的生物標志物。Lorenzen等[21]研究了77例AKI患者血漿miRNAs的指紋圖譜，發現接受腎臟替代治療的AKI危重患者的血漿miR-210上調，多變量Cox比例風險回歸分析和Kaplan-Meier曲線分析均證明血漿miR-210是患者28 d存活率的獨立預測因子。動物實驗[22]發現，miR-10a 和 miR-30d是富集于腎臟的miRNA。小鼠發生AKI時，盡管血漿中的miR-10a 和 miR-30d豐度變化不大，但尿液miR-10a 和 miR-30d豐度顯著增加，且其含量與腎損傷的程度呈正相關。與AKI的其他生物標志物相比，分泌型miRNA具有穩定、不受尿液性狀影響、敏感性高的優勢，可能是更為理想的AKI生物標志物。

6總結

miRNA廣泛涉及細胞最基本的生命活動過程，如分化、增殖、代謝和凋亡等，在疾病中的作用越來越受到關注，并已成為腎臟疾病治療研究的重要靶點，也是AKI研究的熱點。miRNA通過多種機制參與不同病因所導致的AKI發病，是AKI發病的重要調控因子，且是AKI早期診斷和預后預測的生物標志物。但是，miRNAs作為AKI生物標志物的臨床應用和推廣目前仍有一些問題：(1)miRNAs能否反映腎組織細胞是亞致死性損傷、凋亡或壞死；(2)miRNAs能否動態反映腎損傷的演變過程(是在加重還是逐步恢復)；(3)miRNAs能否用于病因的診斷，是單純缺血，還是藥物、毒素所致；(4)miRNAs用于檢測AKI的可行性和經濟效益如何。相信隨著技術的發展和相關研究的深入，上述質疑都能得到解決。

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中圖分類號(復旦大學附屬中山醫院腎內科，上海200032)R692

文獻標識碼A

通訊作者方藝，E-mail:fang.yi@zs-hospital.sh.cn

基金項目：國家自然科學基金(編號：81200557)；上海市衛生局科研計劃課題資助項目(編號：20114275)