肺癌干細胞標志物的研究進展

肺癌干細胞標志物的研究進展

胡騰惠1徐興祥2

作者單位： 410075 中南大學 湘雅二醫院呼吸內科1

225001 揚州大學蘇北人民醫院呼吸內科2

【關鍵詞】肺癌干細胞；標志物；非小細胞肺癌

近年來，肺癌由于發病率和病死率居高不下，已經成為各種惡性腫瘤中致死的主要原因之一[1]，對人類健康和生命造成了嚴重損害。肺癌其治療難點表現為腫瘤耐藥、復發和轉移，盡管人們對于肺癌治療方式的不斷探索，其5年生存率仍徘徊在15%左右[2]。基于腫瘤干細胞的假說，肺癌干細胞可能為肺癌的起源細胞，在肺癌的復發、轉移及耐藥方面發揮著重要作用。對于肺癌干細胞標記物的研究將有助于肺癌干細胞的分離及鑒定，同時也將可能為肺癌的治療提供新的靶點。

一、腫瘤干細胞

大多數實體瘤是由異質細胞群組成，而這些細胞群中有一部分細胞天生具有耐藥性或通過突變獲得耐藥性。化療藥物主要殺死對藥物敏感的細胞，而沒有被殺死的具有耐藥性的腫瘤細胞可以重新生成腫瘤或播散新的腫瘤轉移病灶，這些細胞就是所謂的腫瘤起始細胞，即腫瘤干細胞。Donnenberg等[3]研究表明，經化療藥物作用后仍然存活的具有耐藥性的細胞能夠產生新的具有耐藥性的祖細胞，從而產生新的腫瘤，這些細胞之所以具有耐藥性是因為他們具有一種耐藥性基因(multidrug resistance-1, MDR1)。這種基因編碼一種可以將藥物排出細胞外的泵，這種泵在腫瘤干細胞中高表達，并被認為是腫瘤具有耐藥性的主要原因。腫瘤干細胞已經在急性髓系白血病(acute myelocytic leukemia, AML)、大腦的實體腫瘤、乳腺癌、結腸癌等腫瘤中被發現。腫瘤干細胞在腫瘤的生長，轉移和復發中發揮重要作用。腫瘤干細胞導致腫瘤對化療、放療等治療方式不敏感，而對腫瘤干細胞的深入研究則依賴于其分離鑒定技術的不斷提升，腫瘤干細胞標記物的發現對于腫瘤的預防、治療及預后起著至關重要的作用。然而，到目前為止，肺癌干細胞還沒有特異性的標志物。因此，對于肺癌干細胞標志物的探索仍然是目前的研究熱點。

二、肺癌干細胞標記物

肺癌干細胞的標志物包括表面分子標志物CD133和CD44，功能性標志物ABCG2和ALDH1，參照胚胎多能干細胞的標記物Oct4和SOX2。

1. CD133： CD133也被稱為prominin-1，是一個五次跨膜的細胞表面糖蛋白，它的基因特異性定位于染色體4p15，該染色體包含著與器官成熟，內環境穩定，腫瘤形成和腫瘤侵襲有關的基因。CD133通常被視為腫瘤干細胞的標記物。研究表明在大約50%的非小細胞肺癌、結腸癌、胃癌和卵巢癌中檢測到CD133。肺癌的CD133+細胞能夠作為腫瘤球無限增長；在分化方面，CD133的致癌潛能使得CD133+細胞能夠作為肺癌特定的標記物。此外，CD133+腫瘤細胞相比CD133-能夠更有效地形成廣泛克隆增殖。肺癌干細胞對化療藥物耐藥導致肺癌患者在進行常規化療后效果差[4]。因此，抗CD133靶向治療藥物可以作為一個分子靶向治療來消除肺癌患者的CD133+癌細胞。研究發現，非小細胞肺癌中CD133的表達與非小細胞肺癌的不良預后有關。CD133的表達與非小細胞肺癌的腫瘤分化程度，淋巴結轉移，TNM分期有關。CD133的表達與腫瘤低分化程度(危險比=1.72，95%置信區間：1.19～2.49，固定效應模型P=0.004)和淋巴結轉移(危險比=2.43，95%置信區間：1.42～4.17，隨機效應模型P=0.001)有關[5]；病理分期為Ⅱ，Ⅲ和Ⅳ的NSCLS患者，CD133陽性表達的患者相比CD133陰性表達的患者有著更差的預后[6]。此外， CD133在降低生存率方面是一個獨立的影響因素。CD133的陽性表達表明肺癌患者具有更短的生存時間。另一個研究結果表明CD133不僅在肺癌干細胞中表達，在正常肺組織 (支氣管上皮細胞)中也表達CD133[7]，而且它在致瘤過程中發揮重要作用。除此之外，CD133還可以成為結腸癌，肝癌，膽管癌的預后因子[8]。CD133在48.9%的非小細胞肺癌細胞中表達，但是只有一部分CD133+細胞擁有干細胞特性，這些腫瘤干細胞在常規放化療之后能夠通過自我更新、多分化潛能、增殖能力導致腫瘤的復發和轉移。

2. CD44: CD44是一種細胞膜糖蛋白受體，通過結合透明質酸參與細胞黏附、運動和轉移，CD44和P-糖蛋白共同介導細胞多重耐藥。CD44的表達與其他癌癥相關因子如轉化生長因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)，WNT信號通路相關分子，細胞黏附分子和趨化因子的上調有關。CD44可以通過作為EGFR和ErbB家族受體酪氨酸激酶的共受體影響細胞增殖。調節蛋白(HRG)誘導的ErbB2/ErbB4復合物會激活ErbB2酪氨酸激酶活性，進而激活ERK的磷酸化激酶活性，活化的ERK會增加HAS1，HAS2，HAS3的磷酸化，因此，三個活化的HAS同工酶會導致透明質酸(hyaluronic acid, HA)的產生。HAS同工酶表達下調可損害CD44特定的Cdc42-PAK1/信號通路和細胞骨架的激活以及腫瘤細胞的行為。這些結果表明，HRG激活的ErbB2-ERK信號通路通過調節HAS的磷酸化/激活和HA的產生導致CD44介導的致癌行為。除此之外，CD44還可以通過P13K/AKT級聯來增強細胞的抗凋亡能力[8]。在一個肺癌小鼠模型中，研究發現CD44的缺失會減少肺腺癌的形成，并延長小鼠的生存時間 ，研究認為，CD44可以作為生長因子和細胞因子的傳感器/輔助受體[9]，通過正反饋回路來保持ras基因效應子的活性作用。況且CD44參與EGFR蛋白家族介導的信號通路，在敲除CD44的細胞中Erk活性受到損害，這表明CD44是通過調節下游EGFR的活性來參與MAPK信號通路的激活。因此，CD44可以促進Kras介導的MAPK信號通路的激活，并促進腫瘤細胞的增殖，CD44可以作為Kras依賴的相關癌的靶向治療目標。CD44的過表達與非小細胞肺癌患者的腫瘤分化、組織學類型、臨床TMN分期以及淋巴結轉移有關。在一個CD44在伴有淋巴結轉移的51例非小細胞肺癌研究中，其表達率高達90.2%，表明CD44與非小細胞肺癌淋巴結轉移密切相關。CD44還參與間皮瘤細胞的轉移以及骨肉瘤細胞的轉移及耐藥[10]。 CD44的表達與非小細胞肺癌中肺癌干細胞的特性有關。在十個非小細胞肺癌患者的細胞系中，發現CD44+細胞相比CD44-細胞更具有干細胞特性，在體外更容易形成腫瘤球[11]。而通過觀察從H1299，HKULC4，H1650和HCC827細胞系中分離出的CD44+細胞，發現有10 000個細胞在培養的第30～68天時具有體內成瘤能力，而CD44-細胞在培養的第90天時還不具有成瘤能力[11]。不管是分離出來的還是從CD44+細胞分化來的CD44+細胞，均表達多能性/干性基因(OCT4，NANOG，SOX2)，而CD44-細胞不表達。然而，CD44并不是在所有的非小細胞肺癌患者的細胞內表達，Almatroodi等[12]研究表明CD44標記物的表達在非小細胞肺癌組與非癌癥組比較，SE(P=0.50)和MFI(P=0.53)并無顯著性差異，這讓CD44作為肺癌干細胞標志物的特異性受到質疑。腫瘤干細胞表面標記物的多樣性讓研究人員更傾向于探索腫瘤干細胞的功能性標記物。

3. ABCG2: ABCG2是ATP結合盒轉運蛋白(ABC)的成員之一，ABCG2編碼的蛋白質包含有655個氨基酸，包括一個N-端的ATP結合盒和6個跨膜段。ABCG2首先是從人類耐阿霉素MCF-7乳腺癌細胞中克隆出來，并命名為乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistance protein, BRCP)。ABCG2已被證明在小腸的上皮細胞、肝、乳腺導管、靜脈和毛細血管上皮以及血腦屏障中表達，它起著泵送各種內源性和外源性化合物進出細胞的作用[13]。ABCG2在許多的腫瘤細胞中表達，如膀胱癌，白血病以及其他幾種鱗狀細胞癌[14-15]， ABCG2體外表達升高導致細胞對抗癌藥物如拓撲替康、伊立替康、米托蒽醌(MX)和阿霉素等耐藥。BRCP在鱗狀細胞癌、腺癌、小細胞肺癌中呈中度或重度表達；此外，在腫瘤中血管BCRP的表達比周圍血管明顯增加，表明BCRP具有促進腫瘤中血管再生作用[16]。ABCG2 對于白血病有著很高的預后價值并且通常預示著治療無效[8]。在非小細胞肺癌中，ABCG2 的表達表明了對鉑類藥物的低反應性。具有癌干細胞特性的癌側群細胞(SP細胞)在肺癌耐藥中起主要作用，乳腺癌耐藥蛋白(CPBR/ ABCG2)具有保護癌SP細胞免受細胞毒性藥物攻擊的作用。研究發現具有抑制多種膜蛋白作用的低濃度乙醇同樣能夠抑制肺癌SP細胞中的ABCG2基因，5%的乙醇聯合細胞毒性藥物順鉑可以殺死肺癌中的SP細胞和非SP細胞[17]。Jin xie等[18]研究表明抑制ABCG2的表達可以引起細胞周期蛋白D3的上調和p21的下調來阻滯G0/ G1期細胞周期，表明ABCG2可能與細胞周期進程有關。

4. ALDH1: 乙醛脫氫酶1(aldehyde dehydrogenase 1, ALDH1)是可以用來分離肺癌干細胞的功能性標記物，它可以將細胞內各種醛類解毒酶氧化為羧酸。化療藥物順鉑以及細胞毒性藥物環磷酰胺是經由ALDH1代謝的。造血祖細胞中有著高ALDH1酶活性。在惡性乳腺干細胞中檢測到ALDH1預示著不良預后。Ginestier等[19]在一個免疫功能低下的小鼠與人腫瘤異種移植物的研究中發現高ALDH活性的細胞具有自我更新以及強致瘤能力。除了在血液和乳房中存在ALDH1，ALDH1也存在于正常干細胞群中以及其他器官如大腦、結腸、膀胱的腫瘤干細胞中[20-21]。最近的研究發現ALDH1的表達與肺腫瘤的侵襲性有關。Jiang等[22]發現非小細胞肺癌患者細胞系中表達的ALDH1與肺癌細胞的增殖、自我更新和細胞分化有關，這些細胞同樣也表達肺癌干細胞標記物CD133，表明CD133和ALDH1共同參與肺癌細胞的增殖、自我更新和細胞分化。腫瘤干細胞的功能導致了腫瘤不斷增強的致瘤性以及耐藥性。研究發現ALDH1高表達的腫瘤細胞對厄洛替尼耐藥[23]，與厄洛替尼耐藥有關的基因包括參與細胞周期的基因(E2F1，-2CDC2，-6)和與DNA復制有關的基因(MCM4，-5，-6，-7)，這些基因大部分與肺癌的早期發展和不良預后有關，此外，研究者們還鑒定出了代謝基因如ALDH1A3(具有肺癌干細胞特性的候選標記物)。對于厄洛替尼耐藥的細胞表達高水平的ALDH主要表現為ALDH1/3亞型，通過使用流式細胞儀和ALDEFLUOR試劑，研究者們發現，在對厄洛替尼耐藥的子代細胞群中，子代ALDH基因表達明顯高于親代細胞。Moreb等[24]研究表明ALDH1對于細胞增殖及耐藥有著重要作用。ALDH1的過表達與早期非小細胞肺癌的不良預后有關。這些發現都表明ALDH1可以作為一個功能性標志物用來鑒別肺癌干細胞，并可以作為肺癌的預后指標及其靶向治療目標。

5. Oct4: Oct4也叫Oct3，相對分子量為18×103，是POU轉錄因子家族的成員之一。轉錄因子Oct4在維持胚胎干細胞的多能性和自我更新能力方面起著重要作用。Oct4能誘導成人小鼠神經干細胞的多能性，Oct4在健康的分化組織中不表達，在人胚胎腫瘤中、睪丸生殖細胞腫瘤、精原細胞瘤中可以進行轉錄，敲除Oct4基因的腫瘤干細胞將失去自我更新和增殖能力，并導致腫瘤干細胞的凋亡。Oct4作為一個多功能因子參與干細胞的自我更新和分化以及腫瘤形成和侵襲。研究發現在Oct4A的POU DNA結合結構域上有一個保守的核定位信號(nuclear localization signal, NLS)。NLS可以被轉錄受體識別并將其從細胞質運送至細胞核，而腫瘤的發生與侵襲可能與核運輸機制發生功能障礙有關[25]。Oct4和KPNA2的上調與非小細胞肺癌的低生存率有關，用siRNAs敲除A549和SPS細胞系里的Oct4時，A549和SPS細胞的增殖能力均遭到損害，表現出克隆能力下降，表明Oct4的表達可以促進細胞增殖[25]。Li等[26]運用免疫組化法測定了44個非小細胞肺癌患者和21個良性腫瘤患者的Sox2和Oct4，發現只在腫瘤細胞的細胞核中出現了免疫染色陽性，而在所有的癌前病變組織和良性腫瘤組織中免疫染色為陰性。Oct4主要在肺腺癌中表達，其表達水平與肺癌不良分化、預后及較高的TNM分期有關[27]。

6. Sox2: Sox2是一個具有干細胞多潛能性的基因。定位于染色體3q26.33，編碼與SRY相關的HMG-box家族轉錄因子一致。Sox2是Sox基因家族成員之一，它編碼的Sox蛋白由317個氨基酸組成并參與了早期胚胎形成、神經發育、性別決定乃至腫瘤發生等重要的生物學過程。Sox2基因具有維持胚胎干細胞全能性的作用。Sox2協同Nanog、Oct3/4基因共同參與胚胎干細胞自我更新和分化，并且聯合klf4、c-Myc等基因促使成纖維細胞向多能干細胞轉化[28]。根據肺癌的研究表明，Sox2是一種多效性的原癌基因。Sox2誘導與鱗癌有關的腫瘤相關因子p63和角蛋白6表達，參與鱗癌的分化、轉移和侵襲。肝細胞生長因子受體和Sox2擴增多見于吸煙的肺鱗癌患者。Sox2調節包括c-MYC、WNT1、WNT2和NOTCH1等246個A549肺腺癌側群細胞癌靶基因的表達，維持肺癌側群細胞的腫瘤“干性”。全基因組分析研究發現，Sox2、FGFR1或MYC家族基因擴增驅動小細胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)的發生發展。Sox2通過誘導腫瘤癌信號EGFR及BCL2L1來促進肺癌細胞的增殖與存活。Sox2還是Ⅰ期肺腺癌預后不佳的獨立預測因子，且同復發風險相關。許偉等[29]研究結果顯示，Sox2在NSCLC組織中有較高表達，且鱗癌高于腺癌，而在其他非肺部腫瘤及正常肺組織中表達較低，提示Sox2在NSCLC中的表達具有較高的特異性和敏感性，Sox2可作為NSCLC新的標志物。進一步分析發現，Sox2在NSCLC中的表達與腫瘤體積正相關，這可能同Sox2誘導下游EGFR、IGF-1信號，促進細胞增殖和存活有關。Toschi等[30]研究表明SOX2+患者相比SOX2-患者有更長的生存期，對于早期肺癌患者來說SOX2+患者有更好的預后，而對于Ⅲ、Ⅳ患者，SOX+患者與SOX-患者在生存期方面的比較不具有差異。

肺癌干細胞標記物的發現是人類對肺癌研究的重大突破，它對于肺癌的早期診斷、鑒別、治療都有著重大意義。目前，對于肺癌干細胞標記物的研究是一個熱點，單個標志物對于肺癌的診斷可能不太可靠，然而通過聯合多種標志物可以提高肺癌診斷的特異性和靈敏度，更有可能成為肺癌診斷的金指標。然而目前的診斷仍然傾向于影像學檢查并結合患者的臨床癥狀做出判斷，而肺癌標志物的分離及鑒定將有助于我們靶向治療腫瘤，在不傷害正常細胞的情況下殺滅腫瘤細胞，從而徹底治愈腫瘤。但是我們對于肺癌干細胞的研究才剛剛開始，要想徹底治愈癌癥仍然需要我們的不懈努力。肺癌干細胞的特異性標記物尚不明確，以上所研究的標記物對于腫瘤的病理分期、分化、轉移、復發、預后的作用尚有待進一步研究，肺癌干細胞的信號傳導通路更是錯綜復雜。因此，還需進一步探索更多的未知領域。

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(本文編輯：黃紅稷)

胡騰惠，徐興祥. 肺癌干細胞標志物的研究進展[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2015， 8(5)： 627-630.

·綜述·

收稿日期：(2015-07-14)

文獻標識碼：中圖法分類號： R743.2 A

通訊作者：徐興祥，Email: xuxx63@sina.com

基金項目：國家自然科學基金(81302016)

DOI：10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2015.05.023