中性粒細胞胞外誘捕網與血栓形成的關系

中性粒細胞胞外誘捕網與血栓形成的關系

夏書月郭丹許小楊

劉放王實

作者單位： 110024 沈陽，沈陽醫(yī)學院附屬中心醫(yī)院呼吸內科

【關鍵詞】中性粒細胞外誘捕網；血栓形成；組織因子；中性粒細胞

中性粒細胞在炎癥和血栓形成的之間的相互作用一直是爭論的話題。新近的實驗數據揭示了中性粒細胞在血栓性事件中起著關鍵性作用，中性粒細胞源性組織因子(tissue factor, TF)參與這一過程中。此外，在敗血癥，下肢深靜脈血栓形成和惡性腫瘤的疾病模型中發(fā)現中性粒細胞胞外誘捕網(neutrophil extracellular traps, NETs)在中性粒細胞源性的血栓形成過程擔當重要角色。NETs是由激活的中性粒細胞釋放的DNA、抗茵肽、各種酶以及組蛋白交織排列形成的中性粒細胞胞外網狀結構，為纖維蛋白沉積、血小板誘捕和激活提供支架。最近報道在NETs上依賴性自噬細胞外傳遞TF的現象更支持了中性粒細胞參與血栓形成的過程。中性粒細胞在內皮損傷的部位聚集和激活被認為是血栓形成的啟動事件。NETs內富含高濃度的血栓源性TF可能是靜脈和動脈血栓形成啟動及擴展所必需的。

中性粒細胞作為先天免疫系統(tǒng)的一個重要組成部分，已進化成以抗細菌感染為主要功能的效應細胞，是炎癥反應的重要標志。中性粒細胞在炎癥和血栓形成之間的作用，幾十年來一直爭議不斷。傳統(tǒng)上認為血栓形成只是一種血管或血液疾病，炎癥與血栓形成是兩個互相獨立的病理過程。隨著科學研究的深入，人們發(fā)現血栓形成是一個炎癥過程。1995年，通過組織病理學的觀察和白細胞形態(tài)的測定，研究者發(fā)現在誘導血栓形成的早期血管壁上有嗜中性粒細胞的滲出,隨后出現單核細胞和淋巴細胞，同時許多的TF，如IL-6、MCP-Ⅰ、IL-8也在血栓形成后開始升高[1]。大量的研究證據表明，中性粒細胞在血栓形成過程中起到關鍵性作用。一些研究表明耗竭中性粒細胞能逆轉實驗性血栓形成[2]。而另一些研究認為體內、外中性粒細胞可產生TF[3-6]。2004年，Brinkmann等[7]在用IL-8、脂多糖或乙酸肉豆蔻佛波醇(phorbolmyristateaucetate, PMA)刺激中性粒細胞時發(fā)現，細胞受刺激后能在胞外形成脫離細胞本身的結構，Brinkmann等將其稱為NETs，這為研究中性粒細胞在炎癥和血栓形成途徑之間的相互作用增添了新思路，重新了解和認識血栓形成機制，已成為研究血栓性疾病治療的重要方向。現就近幾年的相關研究進展綜述如下：

一、TF與血栓形成

TF是一個相對分子量為47×103的跨膜糖蛋白，二級和三級結構與干擾素γ受體具有高度同源性，是人Ⅱ類細胞因子受體家族的成員，被認為是體內主要的凝血啟動因子[8]。在正常情況下，血管內皮細胞不表達TF[9]，僅在血管內皮組織下層表達，因此血液和表達點之間產生一個保護層[10-11]。在特定的炎癥條件下，血管內皮細胞和髓系白細胞表達TF[3，12-13]。近年來很多研究認為，血液中有循環(huán)性TF(血液-骨髓細胞的TF)存在。循環(huán)性TF有三個潛在來源：外周血細胞TF[3，14]，TF微顆粒 (TF+microparticles，TF+MPs)[15]和可溶性TF[16]。單核細胞群被認為是TF+MPs主要來源，新的證據表明血液中的其他細胞群可能也是循環(huán)性組織因子的來源[17]。

研究發(fā)現TF與高親和力的Ⅶ因子(factor Ⅶ, FⅦ)相結合，形成TF/FⅦa的復合物，并促使無活性的FⅦ變成有性的FⅦa。除此之外，TF 還可增加FⅦa 和TF/FⅦa 的蛋白水解酶和淀粉酶活性，使X 因子(Fx)轉變?yōu)镕Xa，進而使纖維蛋白原變?yōu)槔w維蛋白，完成外源性途徑的凝血過程。TF/FⅦa 復合物還可以使Ⅸ因子(FⅨ)變成FⅨa，并進而作為Ⅷa 因子(FⅧa)的輔助因子激活FX，從而參與內源性凝血途徑[18]，TF 病理情況下過度表達及活性異常將導致血栓的形成。嵌入膜的TF通常是不具有抗凝活性的，而激活后才能充分發(fā)揮其效力[19]。目前，激活循環(huán)性TF的機制尚未清楚。

外源性凝血系統(tǒng)(TF-軸)除了對血栓形成有作用外，在一些非血栓形成的情況下，例如血管生成，腫瘤的生長和轉移，炎癥，纖維化方面也發(fā)揮作用。絲氨酸蛋白酶途徑，即TF/ⅦA，Xa因子和凝血酶，能夠通過蛋白酶激活受體家族(protease-activated receptor, PAR)釋放信號。通過磷脂酰肌醇激酶 (PI3K)，原酪氨酸激酶，細胞外信號調節(jié)激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)途徑產生細胞內信號[20]。這些途徑的激活可導致細胞分泌具有各種生物學功能的細胞因子和趨化因子[21]。

二、炎癥與血栓形成

臨床研究證實有菌和無菌炎癥性疾病患者的靜脈血栓發(fā)生率高于非炎性疾病，如膿毒病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)、炎癥性腸病及血管炎等，而靜脈血栓形成是其發(fā)病率和病死率的主要因素[22]。同樣發(fā)現炎癥在加速類風濕關節(jié)炎，SLE患者的動脈粥樣硬化改變中也起到關鍵性作用[23]。說明炎癥在血栓形成中起到潛在的觸發(fā)作用。Mackman等[24]的實驗研究支持了這一觀點，他們發(fā)現血栓形成與TF-相關的外源性凝血級聯(lián)激活有關，分泌炎癥介質的內皮細胞和血液細胞表達TF增強，這可能是炎性疾病所致的動脈和靜脈血栓發(fā)病機制的一個重要組成部分。炎癥與血栓形成互為因果。炎癥觸發(fā)血栓，血栓重新激活炎癥導致一個持續(xù)或循環(huán)的炎性狀態(tài)。在關節(jié)炎，抗磷脂綜合征(antiphospholipid syndrome, APS)，缺血/再灌注損傷,膿毒癥的臨床模型中，研究發(fā)現TF-凝血酶系統(tǒng)是導致炎癥反應增強的主要原因，其中TF-FⅦa的復合體是誘導炎癥過程的主要參于者；PARs信號通路在這個過程中起著至關重要的作用[5，25-26]。 TF缺乏、凝血酶抑制劑結合體和PAR2不足可導致炎癥減輕[27]。外源性凝血級聯(lián)抑制劑 [天然抗凝血劑，組織因子途徑抑制物(tissue factor pathway inhibitor, TFPI)，蛋白C和抗凝血酶Ⅲ]可減弱炎癥的持續(xù)發(fā)展[28]。另外，最近研究還表明，凝血酶在C3缺乏的情況下能使C5變?yōu)橛猩锘钚缘腃5a，重新促發(fā)炎癥加重，此通路的生理作用尚不明確[29]。

三、中性粒細胞與組織因子：

中性粒細胞表達TF 早在1971年就已報道，但沒有確鑿的證據發(fā)現中性粒細胞具有產生TF蛋白的能力[30]。近十年來，關于中性粒細胞分泌功能性TF的研究陸續(xù)報道，研究發(fā)現血細胞表達TF，其基因的啟動子是由甲基化嚴格調控的，而單核細胞和中性粒細胞TF啟動子是以非甲基化的形式存在，刺激TF mRNA轉錄。在這方面的研究有不同的結果。Osterud等[31]采用單獨用PLS或用PLS和醇肉豆蔻酸乙酸酯(phorbol myristate acetate, PMA)或腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)聯(lián)合刺激分離的中性粒細胞，結果發(fā)現在培養(yǎng)基上清液中檢測到TF活性是由單核細胞激活血小板所致，而不是中性粒細胞分泌的TF蛋白。de Waard等[32]采用小鼠敗血癥模型的一項體內研究表明，滲透脾臟內的TF陽性細胞群形成粒細胞。這些細胞雖然表達TF蛋白，但不表達TFmRNA，這種結果可能是其他細胞以MPs的形式產生TF被中性粒細胞攝取所致。Egorina等[33]采用血液重組模型和si-RNA轉染TF的細胞研究發(fā)現只有在LPS誘導下單核細胞才表達TF。而這樣的TF僅存在中性粒細胞內，細胞膜上不存在，這說明中性粒細胞獲取單核細胞源性TF而不是它自身合成。這項研究支持了上述研究結果。

上述這些研究結果闡述了在非炎癥狀態(tài)下，TF從單核細胞轉移到中性粒細胞內的機制，但未闡述炎癥時體內中性粒細胞是否能產生TF。另一方面，已經發(fā)現用P-選擇或N-甲酰基甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(fMLP)刺激后，中性粒細胞產生功能性的TF蛋白，但PMA刺激后中性粒細胞無TF蛋白產生。將細胞內表達TF的細胞，用fMLP的刺激后，細胞內小部分TF蛋白轉移到細胞膜上[4]。同一時段的報道在APS模型體外研究中發(fā)現中性粒細胞具有產生TF的能力[6]。研究顯示APS患者的IgG免疫球蛋白觸發(fā)補體活化，隨后產生C5a。中性粒細胞在過敏毒素作用下誘導TF基因轉錄，產生活性TF[6]。這些結果被Redecha等[25]的研究證實，文章認為對胎兒流產起作用的TF是來自于髓系細胞，特別是來自于依賴性C5a的中性粒細胞。阻斷TF會減少滋養(yǎng)層的損傷，降低流產的發(fā)生。同樣，研究還發(fā)現，TF+FⅦa的復合物通過PAR2受體傳遞信號激活中性粒細胞引起滋養(yǎng)細胞損傷和釋放活性氧導致胎兒死亡。除掉細胞胞漿區(qū)TF，使FⅦa與PAR2受體相互作用或敲除PAR2，發(fā)現小鼠體內中性粒細胞活性水平降低，小鼠可正常懷孕[5]。另一項研究發(fā)現從急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress sydrome, ARDS)患者的支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage, BALF)中分離的中性粒細胞可表達TF。其結果緣于C5a和TNF-α協(xié)同作用所致[34]。在體外循環(huán)模型的研究中也發(fā)現中性粒細胞可產生C5a相關性的TF[3]。研究發(fā)現，終末期腎病(end stage renal disease, ESRD)患者的血清可誘導健康人中性粒細胞和單核細胞產生C5a相關的功能性TF。粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF)水平與TF的表達有明顯的相關性[35]。

這些研究提供了中性粒細胞可以產生TF的重要證據，但未回答中性粒細胞是如何使TF以功能狀態(tài)存在于細胞外。新的突破是中性粒細胞生物學行為，特別是對NETS的描述可能成為解決爭議的答案。

四、中性粒細胞對血栓形成起著重要的作用

盡管中性粒細胞產生TF有爭論，但多數體內實驗性非炎癥性血栓和炎癥性血栓都證實中性粒細胞的活性作用。在不同致病因素導致的急性肺損傷動物模型中，將中性粒細胞在炎癥觸發(fā)前耗竭，可阻止肺損傷的發(fā)生。此外，在飲食誘導的動脈粥樣硬化模型中，循環(huán)中性粒細胞在動脈粥樣硬化病變斑塊形成中起到決定性作用[36]。在激活外源性凝血級聯(lián)中，中性粒細胞另一個作用是通過釋放彈性蛋白酶使TFPI降解[37]。TFPI是TF的主要抑制劑。另外，蛋白質二硫鍵異構體，是激活胞質TF的一個關鍵蛋白，被發(fā)現在中性粒細胞有表達[38-39]。因此，無論是通過調節(jié)其分解還是激活其引物，中性粒細胞在激活外源性凝血系統(tǒng)中均發(fā)揮重要的作用。

Darbousset等[40]研究發(fā)現在激光誘導內皮損傷模型中，中性粒細胞與損傷內皮接觸是血栓形成級聯(lián)反應事件的第一步，中性粒細胞來源的TF，盡管在缺乏因子XⅡ的的前提下，也會觸發(fā)血栓形成，說明中性粒細胞在血栓形成中起關鍵性作用。此外，利用深靜脈血栓(deep vein thrombosis, DVT)鼠模型進行研究，采用耗竭中性粒細胞的方法，得到的結論是中性粒細胞在靜脈血栓形成中起到不可缺失的作用[39]。中性粒細胞結合并激活因子XⅡ可加速血栓形成[40]。研究還發(fā)現源于髓樣細胞而不是內皮細胞的TF能激活凝血系統(tǒng)，而單核細胞源性的TF卻不足以觸發(fā)血栓形成。這些研究提供的證據說明中性粒細胞在血栓形成中起了重要作用。標記中性粒細胞的恢復或將成為研究血栓形成突破點。

五、誘捕網NETs和血栓形成

Brinkmann等于2004年在Science上發(fā)表文章，證實中性粒細胞存在阻止病原微生物在機體內擴散的另一種殺菌方式：即中性粒細胞死亡后胞膜破裂，在胞外以自身的DNA為骨架形成網狀結構，網狀結構上吸附了中性粒細胞各種顆粒內所含的殺菌蛋白、水解酶，其中組蛋白含量較多，組蛋白為H1、H2A、H2B、H3 和H4。最近Fuchs等[41]深入研究了NETs形成過程并證明NETs是一種不同于凋亡和壞死的細胞死亡方式的產物。中性粒細胞釋放NETs作為抵御病原體的新機制被引起關注。2007年，Clark等[42]研究發(fā)現，在內毒素血癥的小鼠模型中，血管內的NETs的形成誘捕血小板，隨后活化的血小板誘導內皮損傷造成血流障礙。幾年后，在狒狒DVT模型中發(fā)現NETs誘捕血小板和紅細胞，同時對纖維蛋白沉積和血栓穩(wěn)定起到了三維支架的作用。其中的組蛋白被認為是血小板活化的關鍵因素[41]。另一項研究表明，在與輸血相關的急性肺損傷(transfusion-related a cute lung injury, TRALI)小鼠模型中，中性粒細胞通過釋放NET使組織損傷。更具體地說，活化的血小板能夠刺激中性粒細胞釋放NETs，NETs增加了內皮細胞的通透性[43]。所以，抑制血小板活化可以減少NETs的釋放和組織損傷。封閉組蛋白或DNaseI進行預處理均可減輕TRALI內皮損傷。在小鼠深靜脈血栓形成模型中，采用耗竭中性粒細胞的方法，證實了中性粒細胞是血栓形成的主要因素。研究發(fā)現中性粒細胞通過釋放NET有助于DVT形成，但用DNaseI治療可抑制DVT發(fā)展[39]。瓜氨酸H3組蛋白與血管性血友病因子相互作用被認為是紅細胞血栓的形成(紅色血栓形成)的可能機制。在慢性粒細胞性白血病和實體腫瘤研究中，也發(fā)現中性粒細胞產生NET[44]。通過了解瓜氨酸H3組蛋白和血漿有高濃度DNA的存在，被認為NET釋放與癌癥相關血栓之間有相關性。綜上所述，NET釋放與小鼠DVT模型中XⅡ因子活化致局部血管閉塞引起的靜脈血栓有關。

六、細胞外TF通過NET傳遞

中性粒細胞在血栓形成的作用決定中性粒細胞能否產生功能性TF，正是這種爭論，人們更加關注中性粒細胞內TF是否具有激活凝血系統(tǒng)的能力，因為細胞膜上僅檢測到很少量的TF。

上述研究已經告訴我們,中性粒細胞-骨髓源性TF細胞外傳遞說明NETs上的TF能被識別。von Brühl等[39]首次報道NETs表達TF的現象，提出NETs上的TF活化對血栓形成起到重要作用，而XII因子活化不是必需的。Kambas等[34]證實來自于膿毒癥患者的中性粒細胞以NETs的形式釋放大量TF。NET-骨髓源性TF能夠產生凝血酶，隨后致血小板的活化。耗竭膿毒癥血清中微粒，發(fā)現會重新產生TF，說明中性粒細胞不是從未明來源的TF-MPS復合物中獲得TF。研究還發(fā)現自噬體TF的包含物先于細胞外將TF傳遞到NETs上，這是個自噬過程。自噬依賴性途徑也顯示組蛋白B1(HMGB-1)家族的高遷移率，自噬作用作為一種分泌機制對膜外結合或胞質蛋白上NETs具有作用[44]。體外刺激研究看到，促炎性細胞因子啟動中性粒細胞對TF mRNA翻譯是在細菌吞噬后。這些發(fā)現進一步說明炎癥介質在TF后轉錄調控中起到關鍵性的作用。推測體內NET-TF混合物可能被不同來源細胞(中性粒細胞，血小板，單核細胞等)的MPs所捕獲，但它并沒有改變NETs在炎癥和血栓形成之間的重要作用。

NETs是細胞抗原決定簇和抗微生物蛋白胞外表達的一種機制。NETs通過活性TF暴露于外源性凝血級聯(lián)反應的其他絲氨酸蛋白酶對血栓形成起到支架作用。另外，循環(huán)血小板聚集和活化進一步加劇血流梗阻，聚集的血小板阻止DNase對支架的降解作用。中性粒細胞附著到血管內皮細胞導致NET釋放，隨之微血管血栓形成，這種現象可能是敗血癥發(fā)生發(fā)展的關鍵。自噬可以具有一種選擇性的運輸機制將蛋白質傳遞到NETs。此外，自噬的另外一個作用是調控蛋白上自噬體通過降解或修飾翻譯后蛋白。

臨床上炎癥和血栓形成之間有良好的相關性，中性粒細胞在兩者之間起著重要作用的研究報道近期越來越多，研究證據支持NET在這個過程中起關鍵性作用。中性粒細胞在內皮損傷的部位聚集和激活被認為是血栓形成的啟動事件。NETs含有高濃度的血栓源性TF可能是靜脈和動脈血栓形成的啟動和持續(xù)必需條件。此外，中性粒細胞激活外源性凝血級聯(lián)反應可以通過PAR信號在非血栓形成過程起到重要作用，包括炎癥、腫瘤生物學行為、或纖維化等。

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(本文編輯：王亞南)

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·綜述·

收稿日期：(2015-01-06)

文獻標識碼：中圖法分類號： R563 A

通訊作者：夏書月，Email: syx262@126.com

基金項目：國家科技支撐計劃課題資助(2011BAI11B17)

DOI：10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2015.05.024