趨化因子CCL22對肺癌細胞遷移和侵襲的影響

管彩虹 趙 凱 樓雅芳 朱黎紅 吳 清

趨化因子CCL22對肺癌細胞遷移和侵襲的影響

管彩虹1趙 凱2樓雅芳1朱黎紅1吳 清1

目的觀察趨化因子CCL22對肺癌SBC-5細胞遷移和侵襲能力的影響。方法取肺癌細胞系SBC-5細胞，RPMI-1640培養基培養，5%CO2培養箱孵育，清洗消化后傳代培養。予100ng/mL的 CCL22誘導肺癌 SBC-5細胞，設 Control組、CCL22組（100ng/mL）、MIX 組（CCL22 100ng/mL+蛋白激酶抑制劑U0126 10μmol），觀察細胞遷移及侵襲能力的變化；加入蛋白激酶抑制劑（U0126）后細胞遷移及侵襲能力的變化。結果CCL22誘導肺癌SBC-5細胞后，CCL22組細胞遷移距離（351.9±16.4）μm，明顯大于 Control組的（112.6±27.2）μm 和 MIX 組的（145.1±29.6）μm（P＜0.05），MIX 組和Control組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。CCL22組平均侵襲細胞數（505.5±66.3）個，顯著高于 Control組的（199.2±32.8）個和 MIX 組的（95.7±19.1）個（P＜0.05），MIX 組明顯低于 Control組（P＜0.05）。結論趨化因子CCL22可在體外誘導肺癌SBC-5細胞遷移和侵襲，而蛋白激酶抑制劑（U0126）可抑制CCL22誘導肺癌細胞的遷移及侵襲。

肺癌細胞；趨化因子CCL22；腫瘤侵襲；腫瘤轉移

肺癌常發生骨、肝臟等遠處轉移，在癌細胞轉移過程中，靶器官的趨化作用至關重要。既往研究發現，分化的破骨細胞可產生趨化因子CCL22，其相應的受體為CCR4。我們通過實驗觀察趨化因子CCL22能否誘導可表達CCR4的肺癌細胞（SBC-5細胞）發生遷移和侵襲，為肺癌轉移機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 肺癌細胞系SBC-5（廣州吉妮歐生物科技有限公司）；RPMI-1640培養基（SIGMA公司）；胎牛血清（FBS，Hyclone公司）；蛋白激酶抑制劑（U0126，SIGMA 公司）；PVDF膜（Millipore公司）；ECL Plus發光試劑盒、Western及IP細胞裂解液（碧云天公司）；倒置相差顯微鏡（ECLIPSE Ti-S型，Nikon公司）；流式細胞儀（Accuri C6型）和24-well transwell（BD公司）；凝膠成像儀（Bio-RAD公司）；其他試劑系國產分析純試劑。

1.2 方 法

1.2.1 細胞培養 SBC-5細胞常規復蘇，用10%FBS1×P.S.RPMI-1640培養基 37℃，5%CO2培養箱孵育培養，磷酸鹽緩沖液（0.01M PBS）清洗，0.25%Trypsin消化細胞進行傳代培養并調整細胞狀態。

1.2.2 細胞遷移能力檢查 采用劃痕實驗。取對數生長期細胞，0.25%Trypsin消化、細胞計數，以1×106/孔細胞量布6孔板，待細胞貼壁后，以1%FBS RPMI-1640培養基同步化24h。垂直于平行線用200μL槍頭垂直6孔板布滿細胞底部劃線。用無血清RPMI-1640培養基漂洗兩遍。在顯微鏡下選擇背景最好的三個區域拍照（×100）。設 Control組、CCL22 組（100ng/mL）、MIX 組（CCL22 100ng/mL+蛋白激酶抑制劑U0126，10μmol），每組完全培養基加入相應藥物，37℃，5%CO2培養箱孵育24h。在相差顯微鏡下觀察各組三個選擇區域24h后的遷移情況，拍照（×100）。

1.2.3 Transwell試驗觀察細胞侵襲能力 取對數生長期細胞，以1%FBS RPMI-1640培養基同步化24h。將在4℃融好的Matrigel用冷的無血清RPMI-1640培養基稀釋，取100μL稀釋膠（～25μg）加到24-well transwell上室。放置37℃孵育過夜包被基底膜，取出transwell板，用無血清RPMI-1640培養基輕洗凝膠。取同步化24h細胞0.25%Trypsin消化，收集，計數。制備 5×106/mL，1%FBS RPMI-1640 細胞懸液。取200μL加入上室，下室加入600μL各組培養基。每組完全培養基加入相應藥物，37℃，5%CO2培養箱孵育24h。用棉簽擦去上室非侵襲細胞，移去transwells，倒置，風干。在24孔板中加入500μL含0.1μg結晶紫，把小室放入其中，37℃孵育30min。取出，PBS清洗。直徑上取四個視野，拍照（×100），計數。

1.3 統計學方法 檢測數據用均數±標準差（x±s）表示，應用SPSS13.0軟件對樣本數據進行t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 CCL22對SBC-5細胞遷移能力影響 CCL22誘導SBC-5細胞后，Control組細胞平均遷移距離（112.6±27.2）μm，CCL22 組 細 胞 平 均 遷 移 距 離（351.9±16.4）μm，MIX 組細胞平均遷移距離（145.1±29.6）μm。CCL22組細胞遷移距離明大于 Control組和MIX組（P＜0.05），MIX組和Control組比較差異無統計學意義（P＞0.05），見圖 1～2（插頁）。

2.2 CCL22對SBC-5細胞侵襲能力影響 CCL22誘導SBC-5細胞24h后，穿過基地面細胞數以平均侵襲細胞數±樣本標準差表示。Control組平均侵襲細胞數（199.2±32.8）個，CCL22組平均侵襲細胞數（505.5±66.3）個，MIX組平均侵襲細胞數（95.7±19.1）個。CCL22組顯著高于Control組和MIX組（P＜0.05），MIX組明顯低于 Control組（P＜0.05），見圖3～4（插頁）。

3 討 論

研究[1]證實，靶器官產生的一些細胞因子（如白介素、細胞核因子κB配基受體激活劑、趨化因子等）與腫瘤細胞表達的特異性受體結合，在腫瘤細胞的遷移種植過程中發揮著重要作用。

趨化因子家族是一類由免疫或非免疫細胞分泌的一級結構相似的小分子蛋白，具有多種生物活性，根據其氨基酸序列上前兩個半胱氨酸相對位置不同，可以分為4類，CCL22就是其中一類，在人體中位于16號染色體的CCL22基因編碼上，由樹突細胞和巨噬細胞分泌產生。Nakamura等[2]研究發現分化的破骨細胞也可產生趨化因子CCL22，其相應的受體為 CC 趨化因子受體 4（CCR4）。Phillips等[3]證實了趨化因子CXCLl2及其相應受體CXCR4在非小細胞肺癌嗜器官轉移中具有重要作用。本實驗應用100ng/mL的CCL22處理肺癌SBC-5細胞，24h后細胞轉移和侵襲能力明顯增加，說明肺癌轉移過程不是隨機的，而是有靶器官趨向性。因此，靶器官組織中的趨化因子和肺癌細胞中的特異性受體同時高表達在肺癌的器官特異性轉移的過程中起著非常關鍵的作用。

本研究還發現加入蛋白酶抑制劑U0126后，腫瘤細胞的遷移和侵襲性明顯減弱。以往的研究顯示U0126主要是抑制細胞外信號調節激酶（ERK）磷酸化[4]，ERK可將細胞外刺激傳遞至細胞內，參與細胞的生長、發育、分化等一系列生理活動，并在細胞的惡性轉化和腫瘤的發展中起重要作用。趙凱等[5]研究發現，ERK/MAPK信號轉導通路在乳腺癌骨轉移中被明顯激活。所以除了趨化因子參與腫瘤轉移外，是否還有其它因子或酶參與，有待進一步研究。

因此，腫瘤的轉移部位不是隨機性，而是有一定的趨向性，趨化因子CCL22在體外可以誘導肺癌SBC-5細胞遷移和侵襲，蛋白激酶抑制劑（U0126）可以抑制CCL22誘導肺癌細胞遷移及侵襲。實驗結果可能會為肺癌轉移的治療提供新的實驗依據。

［1］ Vander Griend DJ，Rinker Schaeffer CW.A new look at an old problem：the survival and organ-specific growth of metastases［J］.Sci STKE，2004，（216）：3-9.

［2］ Nakamura Es，Koizumi K，Kobayashi M，et al.RANKL-induced CCL22/macrophage-derived chemokine produced from osteoclasts potentially promotes the bone metastasis of lung cancer expressing its receptor CCR4［J］.Clin Exp Metastasis，2006，23（1）：9-15.

［3］Phillips RJ，Burdick MD，Lutz M，et a1.The stromal derived Factor-1/CXCLl2-CXC chemokine recenter-4 biological axis in non small cen lung cancer metastases［J］.Am J Respir Crit Care Med，2003，167（12）：1676-1681.

［4］Ahn NG，Nahreini TS，Tolwinski NS，et al.Pharmacologic inhibitors of MEK1 and MEK2［J］.Methods Enzymol，2001，332：417-431.

［5］趙凱，譚群亞，楊翀，等.干擾ERK/p-38 MAPK信號通路對乳腺癌骨轉移的影響［J］.中華實驗外科雜志，2011，28（2）：311.

（收稿：2014-06-20 修回：2014-08-01）

Effects of Chemokine CCL22 on Lung Cancer Cell Migration and Invasion

GUAN Caihong1，ZHAO Kai2，LOU Yafang1，ZHU Lihong1，WU Qing1.1 Department of Respiratory Medicine,Hangzhou TCM Hospital,Hangzhou(310009),China;2 Department of Surgery,Hangzhou Red Cross Hospital,Hangzhou（310003），China

Objective To investigate the effect of chemokine CCL22 on migration and invasion of lung cancer cell line SBC-5.MethodsLung cancer cell line SBC-5 cells were cultured with RPMI-1640 medium and incubated in an incubator with 5%CO2,then the cell was washed and digested to subculture.The SBC-5 cells subcultured were divided into control group,CCL22 group（100ng/mL）,and MIX group（CCL22 100ng/mL+protease inhibitor U0126 10μmol）.The cells were treated with the corresponding drugs in each group.Capability of lung cancer cell migration and invasion was observed after treatment in each group.ResultsAfter induction with CCL22,the migration distance of SBC-5 cells was increased（351.9±16.4μm）compared with that in control（112.6±27.2μm）and MIX group（145.1±29.6μm,all P＜0.05）;no significant difference in the migration distance was noted between control and MIX groups（P＞0.05）.Cell invasion in CCL22 group（505.5±66.3） was seen more than that in control（199.2±32.8）and MIX groups（95.7±19.1,all P＜0.05）,and a significant difference was found between the latter two groups（P＜0.05）.ConclusionChemokine CCL22 can induce migration and invasion of lung cancer cell line SBC-5 in vitro,while protease inhibitor（U0126）may inhibit the migration and invasion of lung cancer cells induced by CCL22.

lung cancer cells；chemokine CCL22；tumor invasion；tumor migration

p

浙江省醫藥衛生科技計劃項目（No.2011KYA138）；杭州市醫藥衛生科技計劃項目（No.2011A046）

1杭州市中醫院呼吸科（杭州 310009）；2杭州市紅十字會醫院外科（杭州 310003）

趙凱，E-mail：zhaokaiguan@126.com