神經源性肺水腫大鼠模型的改進與評價

符 暉,王橋生*,劉 雁,周 斌,彭忠田

(1.南華大學附屬第一醫院重癥醫學科,湖南衡陽421001;2.南華大學醫學院)

神經源性肺水腫大鼠模型的改進與評價

符 暉1,王橋生1*,劉 雁2,周 斌2,彭忠田1

(1.南華大學附屬第一醫院重癥醫學科,湖南衡陽421001;2.南華大學醫學院)

目的 評價改進后的小腦延髓池穿刺法制作神經源性肺水腫大鼠模型的使用價值。 方法 60只清潔級SD大鼠隨機均分為4組:正常對照組、假手術組、小腦延髓池穿刺直接注射組(直接注射組)、小腦延髓池穿刺延長留置時間組(延長留置時間組)。延長留置時間組造模成功率達90%。直接注射組采用傳統的小腦延髓池穿刺直接注射法造模;延長留置時間組即小腦延髓池穿刺成功后,在腦池內留置1 mL注射器針頭20 min后注射纖維蛋白原(100 mg/mL)和凝血酶(200 U/mL)各0.075 mL。通過觀察各組大鼠肺大體形態學、病理改變及比較生存時間,評價兩種制模方法的價值。正常對照組不予任何干預。 結果 正常對照組無肺水腫表現。同直接注射組相比,延長留置時間組大鼠肺體積明顯增大,肺泡及肺間質滲出明顯增多。延長留置時間組大鼠生存時間較直接注射組縮短,分別為5.008±2.612 h和7.482±3.034 h(t=2.394,P=0.024)。 結論 小腦延髓池穿刺延長留置時間法復制的神經源性肺水腫癥狀典型,是研究神經源性肺水腫較為理想的動物模型。

神經源性肺水腫; 小腦延髓池; 纖維蛋白原; 凝血酶

神經源性肺水腫(Neurogenic Pulmonary Edema,NPE)是指無原發心、肺、腎疾病,而是由各種中樞神經系統疾病所致的引發急性肺水腫,故又稱為中樞性肺水腫[1]。癥狀表現為呼吸困難、呼吸窘迫、咳粉紅色泡沫痰、咯血、呼吸循環衰竭等急性癥狀。該病發展迅速,死亡率高,但目前NPE的機制還不明確,復制理想的動物模型是研究該疾病的基礎,也是制約實驗研究的主要環節。目前,NPE造模的方法主要包括小腦延髓池穿刺直接注射法[2-3]、腎上腺素腹腔注射法[4]和脊髓損傷法[5-6]等。其中,小腦延髓池穿刺注射法應用較廣,其復制的模型更加符合臨床NPE的病理生理特點。但是,小腦延髓池穿刺直接注射法造模引起NPE程度較輕,發展速度慢,癥狀不明顯,不便于實驗觀察及研究。為復制理想的NPE模型,本文對小腦延髓穿刺法造模進行改進并對其進行了評價。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

纖維蛋白原(長沙鵬博生物科技有限公司);凝血酶(長沙鵬博生物科技有限公司);水合氯醛(長沙鵬博生物科技有限公司)。

1.2 實驗動物及分組

清潔級雄性SD大鼠60只,月齡3～4月,200～250 g,購于湖南斯萊克景達動物有限公司;按照隨機數字法分為4組:(1)正常對照組;(2)假手術組;(3)小腦延髓池穿刺直接注射組(直接注射組);(4)小腦延髓池穿刺延長留置時間組(延長留置時間組)。每組各為15只。

1.3 造模方法

實驗大鼠術前12 h禁食但不禁水,10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射進行麻醉固定,麻醉后氣管切開行氣管插管,用1 mL注射器從枕骨粗隆下0.6～0.7 cm進針,進針深度1.0～1.5 cm,穿刺進入小腦延髓池[7]。直接注射組采用傳統的小腦延髓池穿刺直接注射法,穿刺針進入小腦延髓池后即刻在大鼠腦池內注射纖維蛋白原(100 mg/mL)和凝血酶(200 U/mL)各0.075 mL[3]。延長留置時間組,采用改進的小腦延髓池穿刺延長留置時間法,即穿刺針進入小腦延髓池后在腦池內留置注射器針頭20 min后注射纖維蛋白原(100 mg/mL)和凝血酶(200 U/mL)各0.075 mL。假手術組按實驗方法進行麻醉固定、氣管切開并行氣管插管,但不行小腦延髓池穿刺及注藥。正常對照組不予手術及藥物干預。

1.4 肉眼觀察肺大體標本及病理學檢查

造模6 h后隨機選取5只大鼠進行解剖,肉眼觀察肺臟大體標本顏色、腫脹情況、氣管內水腫液及肺組織切面滲液情況。然后分別經肺門平面、肺門平面以上1.0 cm及肺門平面以下1.0 cm取肺組織予10%的中性甲醛固定,常規石蠟切片,HE染色,光鏡下觀察肺門、肺尖及肺底病理改變。

1.5 觀察大鼠生存時間

造模成功后,每組10只大鼠,記錄各組大鼠生存時間。

1.6 統計學方法

所有數據使用SPSS18.0進行處理。兩組間生存時間用均數+標準差表示,組間比較采用兩獨立樣本t檢驗,以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 一般情況

正常對照組大鼠呼吸平穩,節律齊,唇舌黏膜正常,未聞及濕羅音。而直接注射組造模30 min后均可見明顯呼吸困難,出現呼吸困難、頻率加快、肌肉無力,隨著可見廣泛肌顫、全身抽搐,最后因呼吸衰竭死亡;其中延長留置時間組大鼠進展較直接注射組癥狀更嚴重,嚴重時從鼻孔與口腔涌出血性泡沫樣液體。兩組造模成功率達90%。

2.2 各組大鼠肺大體標本形態學改變

正常對照組及假手術組:雙肺正常、淺粉紅色,表面光滑,未見淤血,切面未見溢出粉紅色液體,分別見圖1A、圖1B。直接注射組:擠壓雙肺可見氣管有泡沫樣液體,大鼠肺體積稍增大,邊緣稍鈍,表面呈暗紅色,氣管分叉處可見淡紅色水腫液。見圖1C。延長留置時間組:氣管內可見泡沫樣液體,肺體積明顯增大、腫脹,邊緣鈍,肺表面呈暗紅色,多發點狀或片狀出血,肺切面有泡沫樣血性液體溢出。見圖1D。

2.3 各組肺組織光鏡下改變

正常對照組及假手術組,經肺尖、肺門及肺底切片,可見肺間質、肺泡形態結構基本正常,未見明顯肺泡、肺間質滲出及出血改變;而直接注射組,經肺尖、肺門及肺底切片均可見肺間質及肺泡腔內可見少量滲出物;延長留置時間組,經肺尖、肺門及肺底切片,可見肺間質滲出增加,肺泡腔內可見大量淡紅 色絮狀滲出物及紅細胞。見圖2。

2.4 大鼠生存時間比較

延長留置時間組大鼠生存時間較直接注射組稍有縮短,分別為5.008±2.612 h和 7.482±3.034 h(t=2.394,P=0.024)。相關標準肺水腫模型生存時間約數十分鐘至數小時不等,這可能與肺水腫發展迅速導致動物死亡所致[8-9]。本文中延長留置時間組大鼠較直接注射組大鼠死亡時間縮短,可能與神經中樞損害加重有關。對實驗研究NPE相關藥物干預或機制并不影響。

3 討 論

NPE是一個復雜的病理過程,是多種因素綜合作用的結果,其發病機制還不明確。目前比較認可的機制是中樞神經系統損傷后,其中延髓是 NPE發生的關鍵神經中樞,機體發生過度應激,交感神經過度興奮引起兒茶酚胺物質大量釋放是導致NPE的重要原因。因此,理想的NPE模型應該吻合這一病理生理機制[1,10-11]。雖然,國內外有一些學者提出不同的NPE造模方法,主要包括小腦延髓池穿刺注射法、腎上腺素腹腔注射法和脊髓損傷法等。薛敬禮等[4]報道腎上腺素經腹腔注射可引起大鼠NPE,誘發肺水腫成功率高,但劑量大小與模型成功與否有很大關系,大部分模型數十分鐘內死亡。大鼠急性脊髓損傷可誘發NPE,但損傷程度不易控制,大鼠很快死亡,死亡原因可能與脊髓損傷有直接關系,不能確定大鼠是否死于NPE[12]。上述模型不完全符合NPE發病機制,不便于實驗觀察及研究。蛛網膜下腔出血可并發NPE[13],但是蛛網膜下腔出血并NPE發病急、進展快、病情重,死亡率高,重復性差,亦不便于實驗觀察及研究。

小腦延髓池穿刺直射法通過分別注入纖維蛋白原及凝血酶,繼發顱內高壓,誘發NPE[2-3]。該模型符合NPE的發病機理。但是,小腦延髓池穿刺直接注射法造模后,亦存在NPE形成慢,癥狀不典型等缺陷。

本文經過小腦延髓池穿刺,通過延長留置穿刺針后再注藥,成功復制了NPE模型。同小腦延髓池穿刺直接注射法造模法相比,延長留置時間法造模,大鼠肺水腫癥狀典型,肺組織大體形態及病理改變更顯著,肺水腫發展程度更重,重復性好,成功率高。同直接注射組相比,雖然延長留置時間組大鼠生存時間縮短,分別為7.482±3.034 h和5.008±2.612 h,具體機制無相關文獻報道,這可能與留置時間組大鼠神經中樞損害加重,肺水腫發展更迅速,發展程度更重有關。但與文獻報道的其他復制NPE模型方法相比,時間明顯延長,可更好地進行實驗觀察和研究。

但是該造模方法也存在以下不足之處:(1)留置時間過長可導致顱腦損傷程度加重,可能誘發腦疝的形成;(2)延長留置時間的過程中可加重腦干損傷,導致呼吸、循環中樞的抑制,直接導致大鼠死亡。因此,要嚴格把握進針深度及時間。

小腦延髓池穿刺延長留置時間法復制的神經源性肺水腫癥狀典型,是研究神經源性肺水腫較為理想的動物模型。

[1]Davison DL,Terek M,Chawla LS.Neurogenic pulmonary edema[J].Crit Care,2012,16(2):212.

[2]Hashiba Y,Ishikawa N,Sumita T,et al.Capsaicin-sensitive nerves exert an inhibitory effect on the development of fibrin-induced pulmonary edema in rats[J].Am Rev Respir Dis,1989,140(3):652-658.

[3]Hamdy O,Maekawa H,Shimada Y,et al.Role of central nervous system nitric oxide in the development of neurogenic pulmonary edema in rats[J].Crit Care Med,2001,29(6):1222-1228.

[4]薛敬禮,史崇敏,章金濤,等.不同方法誘發大鼠肺水腫動物模型的比較研究[J].河南醫學研究,2006,15(2):109-111.

[5]Sedy J,Zicha J,Nedvidkova J,et al.The role of sympathetic nervous system in the development of neurogenic pulmonary edema in spinal cord-injured rats[J].J Appl Physiol(1985),2012,112(1):1-8.

[6]Sedy J,Zicha J,Kunes J,et al.The role of nitric oxide in the development of neurogenic pulmonary edema in spinal cord-injured rats:the effect of preventive interventions[J].Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol,2009,297(4):R1111-R1117.

[7]富宏,陶迎紅,王學美,等.經皮穿刺延髓池抽取兔和大鼠腦脊液的方法[J].中國比較醫學雜志,2006,16(11):684-687.

[8]Hamdy O,Maekawa H,Shimada Y,et al.Role of central nervous system nitric oxide in the development of neurogenic pulmonary edema in rats[J].Crit Care Med,2001,29(6):1222-1228.

[9]Bosso FJ,Lang SA,Maron MB.Role of hemodynamics and vagus nerves in development of fibrin-induced pulmonary edema[J].J Appl Physiol(1985).1990,69(6):2227-2232.

[10]呂勇,劉子美.神經源性肺水腫的診斷與治療進展[J].安徽醫學,2009,30(3):246-248.

[11]Baumann A,Audibert G,Mcdonnell J,et al.Neurogenic pulmonary edema[J].Acta Anaesthesiol Scand,2007,51(4):447-455.

[12]張劭博,紀瑞華,鄒最,等.異氟烷對大鼠急性脊髓損傷后神經源性肺水腫的影響[J].中國矯形外科雜志,2009,17(8):617-620.

[13]Chen S,Zhu Z,Klebe D,et al.Role of P2X purinoceptor 7 in neurogenic pulmonary edema after subarachnoid hemorrhage in rats[J].PLoSOne,2014,9(2):e89042.

Improvement of Neurogenic Pulmonary Edema Model Induced by Cerebellomedullary Cistern Puncture in Rats

FU Hui,WANG Qiaosheng,LIU Yan,et al
(Department of Critical Care Medicine,the First Affiliated Hospital,University of South China,Hengyang,Hunan 421001,China)

Objective To evaluate the worth of neurogenic pulmonary edema model induced by improved cerebellomedullary cistern puncture. Methods 60 SD ras were randomly divided into four groups:control group(n=15);Sham operation group(n=15);direct injection through cerebellomedullary cistern puncture group(abbreviated:direct injection group,n=15);prolonging the indwelling time and injection through cerebellomedullary cistern puncture group(abbreviated:prolonging indwelling time group,n=15).90%of them is successful in the prolonging indwelling time group.Neurogenic pulmonary edema model was induced by classic cerebellomedullary cistern puncture in the direct injection group,however,that in the prolonging indwelling time group was induced by injecting 0.75 mL Fibrinogen(100 mg/mL)and 0.75 mL thrombin(200 U/mL)respectively after 20 min indwelling needle maintained in cerebellomedullary cistern.The experimental parameters including pulmonary morphology,pathology change and survival time in each group were evaluated. Results The pulmonary edema of rats did not be discovered in the control group,however,that in the direct injection group and prolonging indwelling time group were both discovered significantly.Compared with the rats in the direct injection group,the lung volume,exudation of the pulmonary alveoli and pulmonary interstitium increased significantly in the prolonging indwelling time group.Survival time of the rats in the prolonging indwelling time group was shorter than that of the direct injection group,they are(5.008+2.612)h and(7.482+3.034)h,respectively,(t=2.394,P=0.024). Conclusion It is perfect NPE model for research that the modified NPE model has typical NPE symptoms.

neurogenic pulmonary edema; cerebellomedullary cistern; fibrinogen; thrombin

2014-08-08;

2014-12-01

湖南省醫藥衛生科研計劃課題項目(B2013-040);湖南省科技計劃項目(項目編號:2014SK3088).

*通訊作者,E-mail:docwqs@163.com.

R563

A

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.02.005

(此文編輯:蔣湘蓮)