心臟干細胞活化相關分子在心血管疾病中的作用

邱光昊 ，張正斌 ，翟蒙恩 ，程 亮，劉 洋，孫云蕊，宋思敏，梁宏亮，劉金成

·綜述與進展·

心臟干細胞活化相關分子在心血管疾病中的作用

邱光昊1，張正斌1，翟蒙恩2，程 亮2，劉 洋2，孫云蕊1，宋思敏1，梁宏亮2，劉金成2

胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)、肝細胞生長因子(Hepatocyte growth factor，HGF)在許多干細胞中都發揮積極作用，心臟干細胞(cardiac stem cells，CSCs)作為研究比較多的對心肌缺血性疾病有重要治療作用的細胞也日益受到重視。近年來發現CSCs活化對于治療的意義非常明確，而IGF/HGF是激發其活化態的重要分子，并且二者作用的信號通路有一定重疊，對于研究CSCs活化的分子機制有重要作用。二者還可以促進CSCs的遷移、促進增殖、抗凋亡等。

心血管疾病； 心臟干細胞； 胰島素樣生長因子-1； 肝細胞生長因子

心腦血管疾病已經成為威脅人類生命的第一殺手，其中心肌缺血性疾病危害最大。心肌梗死通常會對機體造成不可逆的心功能損害，從而影響患者預后以及生活質量。現有治療只停留在提高心功能和減輕心臟負荷上，尚不能重建心肌，因此迫切需要能修復壞死組織并顯著提高心功能的治療手段。已有研究表明心臟干細胞(CSCs)移植具有諸多優點，細胞因子作用下的心臟干細胞比單純干細胞移植更明顯地改善心功能，在治療方面擁有很大的潛能。

1 CSCs治療心臟疾病相關進展

心肌組織在新生兒期存在自我更新能力，成年階段的心肌組織更新能力受限。并且隨著年齡的增長，主質細胞的數量和功能會不斷降低。因此，對于組織缺損相關疾病的診治大多停留在發揮和保留殘留主質細胞的功能上。

2002 年，Quaini 等[1]首次在人體心臟中發現了一類可分化細胞，具有干細胞的特征。Beltrami等[2]在成年大鼠心臟中發現可表達cKit+受體的細胞。內源性CSCs存在于不同物種的哺乳動物中包括人類[3]。最近的研究顯示哺乳動物的心臟中存在一群固有的干細胞，活化后能夠遷移入梗死的心肌組織中，重建受損組織并改善心室功能，新生的心肌組織包含心肌的各種細胞和血管，證實成人心臟在受損后具有額外的生長潛能[4]。植入梗死區的CSCs具有分化成心肌細胞、平滑肌細胞和血管內皮細胞的能力，進而生成具有收縮功能的肌肉組織、微脈管系統和結締組織[3]。在成人的心肌組織中，大多數干細胞處于沉默狀態，少部分經活化后參與修復壞死的心肌細胞和血管細胞。在缺氧、超負荷壓力等應激條件下，相當一部分干細胞被迅速激活，參與組織修復[5]。

心臟細胞治療代表了心臟疾病治療的新領域，研究顯示這種治療能夠改善心臟結構和功能，并且移植的干細胞能夠使梗死區減小、變薄。CSCs發揮作用的機制主要包括直接分化和旁分泌，直接分化指由干細胞增殖分化形成心肌細胞，是細胞治療的主要方式。另一種機制是“旁分泌假說”，該假說認為移植的CSCs所分泌的細胞因子、生長因子等作用于心肌組織才是CSCs發揮治療作用的主要機制[6-7]。另外，有學者發現CSCs表達相應的胰島樣生長因子α-1(IGF-1)以及肝細胞生長因子(HGF)受體，提示自分泌反饋機制的存在，即CSCs可以通過自分泌IGF-1和HGF作用于自身受體發揮相應作用。

CSCs受到細胞因子和生長因子的激活促使其移行、分化、增殖，從而替代損失的心肌細胞。小鼠經干細胞移植1周后，可在梗死區檢測到HGF和IGF-1，同時在遠離梗死區和中隔部位也可檢測出，濃度隨時間延長而降低[7]。肝細胞生長因子-c-甲硫氨酸系統(HGF-c-Met)和胰島素樣生長因子1-受體系統(IGF-1-IGF-1R)發揮了重要作用[8]。在此就這兩種活化系統進行討論。

2 CSCs在HGF/IGF-1作用下的生物學效應

IGF-1/HGF屬于干細胞因子(stem cell factor，SCF)是糖基化的跨膜蛋白，在間質細胞、成纖維細胞、內皮和心肌組織均可表達。心肌梗死時IGF/HGF的濃度迅速增加[9]，CSCs本身也可分泌IGF-1/HGF[7]，也有實驗在體外通過采用含有IGF-1/HGF的培養基培養CSCs[8]。

CSCs能夠促進心肌細胞的存活、增殖、減少纖維化和心肌細胞反應性肥大。在體外實驗中發現CSCs的分化作用增強，最終減小梗死面積、改善左室功能。CSCs移植到缺血性心肌組織并接受IGF-1和HGF的活化證實了IGF/HGF有以下功能：①通過冠脈向梗死區域注入小劑量IGF-1/HGF能夠促進心肌存活和修復重建，對心肌組織結構有很強的保護作用；②冠脈內IGF-1/HGF能夠激活內源性CSCs以發揮其分化發育成肌細胞以及修復因缺血性損傷導致的微脈管系統缺失，形成中等血管、阻力血管以及微血管；③CSCs受活化的強度、心肌的存活和細胞增殖都直接受到IGF-1/HGF劑量依賴性的調控；④IGF-1/HGF通過減少細胞死亡、減小梗死面積和預防左心室擴張來改善心功能[10]。

大多數的CSCs都表達c-Met和IGF-1受體。相關研究顯示生長因子活化的CSCs無血清培養基的上清液中，HGF和IGF-1濃度增長很快，在30 min～120 min分別增長了13倍和26倍。在體內的增長包括鼠HGF和IGF-1的mRNA和蛋白質。這些證據表明CSCs擁有綜合處理這些生長因子的能力，并且在體外HGF和IGF-1的濃度增長呈時間依賴性的現象更明確地支持該結論。因此CSCs擁有HGF-c-Met和IGF-1-IGF-1R系統[4]。

100 ng/mL HGF可趨化CSCs。HGF在趨化試劑盒里能使7倍數量的CSCs聚集起來。IGF也有一定的趨化能力。在HGF的作用下，CSCs能溶解明膠并分泌金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9，IGF同樣對MMP具有一定的作用。在實驗中發現IGF-1和HGF能分別降低CSCs94%和58%的凋亡率，IGF-1活化的CSCs的數量增加了11倍而HGF則增加了3倍[4]。同時，HGF可以通過促進MMP-9的分泌破壞細胞外基質從而促使細胞移動、歸巢和組織重構[11- 12]。因此通過注射HGF分子可促進CSCs向梗死區域遷移和歸巢。

3 IGF-1與HGF作用于CSCs的分子機制

3.1 IGF-1與CSCs

3.1.1 IGF-1-IGF-1R作用機制 IGF-1與受體結合可激活酪氨酸激酶，磷酸化細胞內底物如胰島素受體底物-1(insulin receptor substrate-1，IRS-1)和Shc激活下游信號分子，包括PI3K/Akt通路。IGF-1R通過若干個酪氨酸磷酸化位點發揮作用，通過募集胰島素受體底物-2(insulin receptor substrate-2，IRS-2)并使其磷酸化從而活化下游PI3K分子。PI3K磷酸化磷酸肌醇依賴的蛋白激酶-1 (phosphoinositidedependent protein kinase1，PDK1)[13]。活化的PI3K能使4，5-二磷酸磷脂酰肌醇PtdIns(4，5)P2和PtdIns(4)P發生D3磷酸化，產生PtdIns(3，4，5)P3和PtdIns(3，4)P2，而PtdIns(3，4，5)P3能被磷脂磷酸酶轉變為PtdIns(3，4)P2。積累起來的PtdIns(3，4，5)P3和PtdIns(3，4)P2募集包含血小板-白細胞C激酶底物(PH)結構域的Akt添加到質膜上，被PH結構域覆蓋住的Thr308被暴露出來。隨后，PDK1所包含的羧基端PH結構域磷酸化Thr308。盡管磷酸化Thr308能夠局部磷酸化Akt，羧基端Ser473的磷酸化對于誘導Akt的全面活化是必需的。然而Ser473的磷酸化機制仍然未能了解，因此，作用于此部位的激酶被認為是“PDK2”。在某些情況下PDK1能夠磷酸化兩個結構。Ser的自身磷酸化也有報道。整聯蛋白連接的激酶(ILK)能夠磷酸化Ser473，而這種機制是否作為直接磷酸化“PDK2”仍存爭議[14]。

最近的研究數據顯示CSCs的衰老能導致心肌細胞衰老和心衰，隨著其不斷衰老，其細胞功能也會喪失。并且隨著年齡增長不斷縮短端粒酶的CSCs，其子代細胞會遺傳母代細胞的短端粒酶表型。經過數輪分裂后會表達衰老相關的蛋白 p16INK4a[15]。IGF能夠促進CSCs分裂、上調端粒酶功能、阻止細胞復制性衰老。IGF還具有減少氧化應激的功能[16]。

3.1.2 IGF-1R下游信號通路主要包括 ①IGF-1-PI3K-Akt-eNOS途徑，Akt的活化能夠促進多種靶蛋白的磷酸化，包括內皮一氧化氮合酶(eNOS)，通過使用LY294002封閉PI3K-Akt信號阻止Akt/eNOS活化，結果使心肌細胞凋亡率和梗死面積增大[9]。心肌梗死后PI3K-Akt-eNOS信號通路的表達明顯增強。結果表明IGF分子的作用可以通過活化PI3K-Akt-eNOS信號通路實現。②IGF-1-Ca2+途徑，IGF-1能夠通過活化1，4，5三磷酸肌醇受體(1，4，5-triphosphate receptors，IP3Rs)來誘導細胞內鈣震蕩(Ca oscillatory)，可以促使鈣離子從內質網中釋放從而發揮CSCs的促有絲分裂作用。然而此通路具體級聯作用機制并不清楚[17]。③IGF-1-PI3K-Akt-FoxO3a途徑， Akt另一個重要的下游信號分子是FoxO3a，具有負向調控細胞周期的作用。Johnson AM通過使用LY294002和渥曼青霉素以去除IGF-1對于FoxO3a的磷酸化作用證明其磷酸化受到PI3K-Akt途徑的調控。并發現IGF-1介導的CSCs增殖作用與FoxO3a的磷酸化和其轉錄活性的失活有關[18]。

3.2 HGF與CSCs

3.2.1 HGF-c-Met作用機制 HGF結合Met二聚體使其酪氨酸激酶活性被激活，在其酪氨酸殘基Y1349和Y1356上發生磷酸化。磷酸化的Met與細胞內底物結合如Gab1、Grb2和PI3K。Gab1能夠結合磷酸化的Y1349，Grb2能夠結合磷酸化的Y1356。大部分Gab1和Grb2包含SH2結構域。磷酸化的Gab1的底物是Shp2、PI3K和磷脂酶C。磷酸化的Grb2結合ras和raf，raf激活MAPK，ras激活ERK[19]。

3.2.2 c-Met下游信號通路HGF-PI3K-Akt途徑 研究顯示HGF同樣具有與IGF-1相同的PI3K-Akt通路，激活eNOS發揮減緩梗死后疾病進程的作用[9]。Akt能夠激活眾多下游信號分子，然而涉及CSCs的相關研究較少，具體通路缺乏證據。

3.2.3 基因治療 如今有藥理學和基因手段通過移植入經過基因修改的干細胞來促進肌組織的再生。主要有以下幾種方式：①修改體內的原位干細胞；②增強細胞增殖和分化能力；③在受損肌組織中增加細胞數量并增強其存活能力[20]。CSCs本身只表達低水平的HGF和Met[21]，固有的CSCs大多處于靜止態[22]，HGF可以使靜止態的CSCs活化，通過移植HGF過表達的CSCs可發揮其自分泌作用正反饋促進CSCs的活化。到目前為止，有研究通過對脂肪衍生干細胞采用HGF基因轉移的方式促進HGF表達從而減弱缺血性損傷的影響[23]。另外，HGF還能夠誘導胚胎干細胞表達心臟特異性標志[21]。

另一種方式是將腺病毒5介導的HGF基因通過冠狀動脈灌注的方法轉移入心肌組織中，使心肌組織過表達HGF從而改善心功能，并得到如下結果：①心肌組織能夠高表達HGF；②表達CD117和c-Met的干細胞數量增多明顯；③心功能有顯著改善[24]。

4 展 望

綜上所述，HGF和IGF-1對于CSCs的活化起到了相當重要的作用，干細胞移植作為近年來新興的治療方式讓心肌梗死病人的預后得到了改善，也讓心肌梗死的治療得到了很大的發展，然而HGF和IGF-1分子在其他干細胞(如間充質干細胞)的試驗中被證實可通過多條信號通路(涉及包括ERK和MAPK等分子在內)發揮作用，其中涉及CSCs的相對較少。在不同的試驗中所取得的實驗結果不盡相同，對相應心臟功能并無根本性改善，有關的處理方式、注射部位、注射時間等還有待試驗驗證。如今CSCs的研究大多停留在動物實驗的層面，長期實驗相關的安全性、可行性還有待進一步確認。同時，自體CSCs的分離純化培養需要數周時間，費用較高、操作復雜繁瑣，這都阻礙了干細胞移植的發展。相信日后會有更簡便快捷的分離提純方法并能夠更好地應用。

通過相應研究的進展，發現通過基因轉染等方式將表達相應生長因子的基因轉移至能夠穩定表達的細胞中并使其在心肌組織定居。轉基因表達的HGF等分子通過旁分泌的機制使其維持較高濃度，持續促進CSCs的活化，可以發揮改善心功能、阻止疾病進展的作用。同時，也可探索將相關基因轉入CSCs內一并移植入心肌組織中持續表達，通過自分泌機制分泌HGF、IGF-1等分子直接作用于CSCs細胞膜表面的受體發揮積極作用。

可以預見，隨著研究的不斷深入，干細胞移植對于心梗患者的治療將開辟一條嶄新的道路。

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(本文編輯 王雅潔)

Cardiac Stem Cells Activiton Related Molecules and Its Function in Cardiovascular Diseases

Qiu Guanghao，Zhang Zhengbin，Zhai Meng’en，Cheng Liang，Liu Yang，Sun Yunrui，Song Simin，Liang Hongliang，Liu JingCheng The Fourth Military Medical University，Xi’an 710032，Shaanxi，China

Corresponding Author：Liang Hongliang(XiJing Hospital， the Fourth Military Medical University，Xi'an 710032，Shaaxi，China)

Insulin-like growth factor (IGF)-1 and hepatocyte growth factor (HGF) in many stem cells play a positive role.Cardiac stem cells(CSCs)，as an important therapeutic stem cells to myocardial ischemic disease are getting increasingly attention.In recent years found that the treatment meaning of the activation of CSCs is clear.HGF/IGF-1 are the important molecules to excite the activation state of CSCs，and they have some overlap signaling pathways.They can also promote CSCs migration，proliferation，apoptosis，etc.

cardiovascular diseases；insulin-like growth factor；hepatocyte growth factor；cardiac stem cells

國家自然科學基金資助(No.81200151，81200708)

1.中國人民解放軍第四軍醫大學(西安 710032)，E-mail：1907955671@qq.com；2.第四軍醫大學西京醫院

梁宏亮，E-mail：dr.lianghongliang@hotmail.com

R54 R256

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2015.17.010

1672-1349(2015)17-1946-04

2015-08-27)