NOD1和NOD2介導的信號通路研究進展

鄭 媛安 麗仇 杰施 瑋.濟南市中心醫院兒科，山東濟南 5003；.山東大學醫學院，山東濟南 5003；3.濟南市中心醫院婦產科，山東濟南 5003

NOD1和NOD2介導的信號通路研究進展

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1.濟南市中心醫院兒科，山東濟南 250013；2.山東大學醫學院，山東濟南 250013；3.濟南市中心醫院婦產科，山東濟南 250013

[摘要]NOD樣受體是一類新型胞漿內的固有免疫模式識別受體，在自身免疫調節中起重要作用，一旦被激活，這些分子觸發細胞內信號通路，導致激活轉錄反應，最終在一個炎性基因子集上表達。在本文中，我們將專注于NOD1 和NOD2在識別和響應細胞內的病原體(包括革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌)的作用，以及它們在非肽聚糖含有病原體（例如病毒和原生動物寄生蟲）的信號應答。

[關鍵詞]NOD1；NOD2；胞內病原體；固有免疫

▲通訊作者

固有免疫系統能夠識別多種致病微生物，是機體防御病原微生物的第一道防線。它通過特殊的模式識別受體（PRRs）感知病原體相關分子模式來識別入侵的病原體。它們可以被含有PRR的免疫細胞識別，進而啟動免疫應答[1]。模式識別受體目前發現至少4種[2]，主要包括膜表面的Toll樣受體家族（Toll like rectors，TLR）、胞漿內NOD樣受體家族（NLR）、C型植物血凝素受體（C-type lectin receptors，CLR）、RIG樣受體（retinoicacid inducible gene like helicase，RLH）。

1 NOD1和NOD2的結構與功能

NLRs家族主要含有3種共同結構域[3]：N端胱冬酶募集域（caspase recuriment domain，CARD）或神經原性細胞凋亡抑制蛋白結合域；位于NLR分子中間起到活化和寡聚化作用的NACHT結構域；C端的亮氨酸重復序列（LRRs）。所以根據NACHT結構域不同，NLRs家族可分為幾個亞類：NLRPs，NODs，NAIP，IPAF和CIITA。NOD（nucleotide oligomerization domain）蛋白可以識別細菌肽聚糖（peptidoglycan，PGN），活化核因子κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB），并誘導炎癥反應。

NOD1和NOD2是固有免疫的胞質受體，能感知革蘭氏陰陽性菌的肽聚糖。它們的功能已被廣泛研究[4-6]，揭示了它們在宿主防御病原體起到關鍵作用，如單核細胞增多性李斯特菌，幽門螺桿菌，葡萄球菌等。在人體中，NOD受體，特別是NOD2受體的變異所致的NOD信號通路失調與炎癥性腸病——克羅恩病有關。NOD通路的異常活化還會導致Blau綜合征或早發的肉瘤樣病變，兩者都是以家族性肉芽腫性關節炎及皮膚肉芽腫為主要特征[7]。

2 NOD的穩定性、自身抑制及降解

NOD通過NACHT和LRR結構域以及細胞伴侶的相互作用使其在細胞內保持未激活、自身抑制的構象。Hahn[8]最早提出了NOD1與伴侶蛋白——熱休克蛋白90（HSP90）相互作用，熱休克蛋白90通過與某些植物R蛋白類似的方式為維持NOD1穩定性。Silva Correia等[8]將假說延伸應用到NOD2上。他們應用HSP90 SiRNA及一個小分子的HSP90抑制劑——格爾德霉素（geldanamycin）實驗顯示了HSP90在MCF-7細胞（人乳腺癌細胞）中維持NOD1和NOD2穩定性的重要性。該實驗組接著研究了另一個R蛋白活性調節因子——SGT-1的作用。當SGT-1與NOD1和NOD2結合，SGT-1只對NOD1的細胞因子信號通路表現作用，且通過SiRNA敲除SGT-1基因不影響NOD1和NOD2的穩定性。其后，Mayor等[9]通過實驗表明了SGT-1和HSP90對NOD2信號通路同樣重要，雖然該實驗是通過限制了格爾德霉素對胞壁酰二肽（MDP）激活的信號通路的抑制作用間接表明的。

Lee等[10]重復了HSP90與NOD2關系的實驗，證明了HSP90對維持NOD2穩定性的重要性。在該實驗中，HSP90作為負反饋調節的一部分，NOD2的激活導致負反饋調節從HSP90處中斷并繼發蛋白酶體依賴性降解。HSP90的作用再次由小分子抑制劑的應用得到證明，而蛋白酶體抑制劑MG-132阻斷了NOD2的降解[10]。同時負反饋調節從HSP90處中斷表明其包含了結合NOD2的MDP誘導蛋白——SOCS3，該蛋白至少部分參與NOD2的泛素化并引發了蛋白酶體性降解。SOCS3 和HSP90都與NOD2的CARD結構域結合，所以兩者可能是互斥的復合體，且有假設認為SOCS3可將NOD2與某至今未知的E3連接酶相連接，參與該過程的E3連接酶可能為TRIM27，有報道認為TRIM27對NOD2的泛素化及降解起重要作用[11]。

3 NOD2配體的識別

NOD2是肽聚糖MDP的真正的胞漿受體。誘導MDP進入胞漿可通過多條通路實現，包括多肽載體SLC15A1，3，4；侵襲性細菌肽聚糖脫落，如福氏志賀菌；以及吸收革蘭氏陰性菌釋放的囊泡[12]。

近期研究[13]通過生物物理和生物化學方法表明MDP直接與NOD2相互作用。普遍認為，識別作用由NOD2的LRRs結構域介導。NOD2也可進行自我活化，該過程在由于NOD2多態性造成的罕見常染色體顯性的炎癥性疾病Blau綜合征中可以得到檢測[14]。造成Blau綜合征的NOD2單核苷酸多態位點集中在NOD2的兩個區域——核苷酸/Mg2+結合位點及位于NACHT和LRR結構域間的HD1。這間接表明了NOD2自我活化的發生機制可能是由于干擾了核苷酸的結合和水解，或者是干擾了分子伴侶的結合以及NOD2的NACHT、HD1及LRR之間的分子內聯系。

4 NOD2與適配蛋白RIP2

RIP2是目前研究最多的與NOD2相互作用的蛋白質，RIP2在NOD1和NOD2的下游NF-kB通路及MAPK通路的活化中起重要作用。雖然RIP2在NOD通路的重要性已被證明，但RIP2與NOD1、NOD2相互作用過程中仍存在許多問題，其在MAPK通路及自噬作用中發揮的確切作用，其激酶結構域的用途及其多種翻譯后修飾的作用。

RIP2的結構由N端的激酶結構域、中央連接區及C端的CARD構成。NOD2的兩個CARD結構域共同過表達是激活下游的NF-κB通路所必須的，但CARD結構域獨立表達時無法激活。所以單獨的NOD2的CARD結構域無法RIP2結合，并且任何一個CARD結構域的某個特殊位點發生變異都無法與RIP2結合并阻斷NF-κB信號通路[15]。根據報道稱能與RIP2結合的最小的NOD2中的區段為NOD-2S[16]，該區段包括CARDa和CARDb的前三個螺旋結構。盡管可與RIP2結合，但NOD-2S的過表達并無法激活NF-κB通路。由此，該檢測表明RIP2與NODs結合并不足以完成NF-κB的激活，這與近期關于NOD1與RIP2的研究結果一致[16]。實際上，RIP2介導的NOD2信號通路可能需要：以特定的構象聚合的復合體；翻譯后修飾；NOD2的CARD結構域自身的相互作用或其他必要蛋白質的結合。雖然NOD1和NOD2的CARD結構域表現出自身的相互作用，但至今這些相互作用的生理學相關性尚未明確。

5 NOD2信號通路中RIP2的翻譯后修飾的重要性

RIP2的磷酸化多發生在暴露在外的可變形區域。RIP2激酶結構域內的兩個磷酸絲氨酸殘基為S168和S176，位于RIP2晶體結構內的未知區域，且在RIP1和RIP3的晶體結構內不存在同源性殘基。通過大規模的激酶組分析探測到的兩個磷酸絲氨酸——S363和S393位于RIP2中間結構域靠近Y381的區域內。同時，Y520位于CARD結構域預測終端的邊緣的兩個脯氨酸殘基之間，且RIP2可變形的C端區域包含四個已知的磷酸化位點——S527，S529，S531及S539。

近期研究表明[17]，至少五種E3連接酶參與RIP2的泛素化，包括ITCH，cIAP1，cIAP2 ，XIAP 及Pellino3。由cIAP2、XIAP和Pellino3介導的RIP2泛素化增強了NF-κB和JNK信號通路，而由ITCH介導的RIP2泛素化減弱了NF-κB信號通路但增強了JNK和MAPK磷酸化。K209被認為是RIP2泛素化的一個重要位點[18]，但與該泛素化相關的E3連接酶尚未明確。K209殘基在RIP1和RIP4中保守存在并可能在這些蛋白質中起類似作用。

6 NOD1和NOD2在細菌感染中的作用

研究認為NOD1和NOD2的功能特性是識別肽聚糖的細胞內受體[19]。這些研究表明NOD1對革蘭陰性菌敏感，而NOD2對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌都敏感。

NOD1和NOD2識別致病菌的作用，在相應目標基因沉默的突變鼠上被進一步證明。NOD2功能的初步研究[20]是使用NOD2基因敲除鼠進行的，其是通過在第二個CARD域的第一部分重編碼第一個外顯因子制成的。令人驚奇的，盡管從這些小鼠獲得BMDMs沒有回應MDP刺激，這些小鼠并沒有表現出明顯的腸功能紊亂，從而形成了 NOD2的功能缺失[20]。隨后，另外兩個NOD2轉基因鼠被設計：一個是在LRR域末端植入基因突變碼，另一個是在Card15位點植入突變基因。Pauleau 等[21]報告顯示，在正常光照與喂養情況下，這兩種方法培育出的小鼠均沒有顯示出腸道疾病。

雖然NOD2-/-鼠沒有顯示出任何腸道炎癥，研究證實它增加了細菌感染的易感性。對于李斯特菌感染，NOD2在限制細菌繁殖上起到了重要作用。在感染幽門螺桿菌的NOD1-/-鼠上也觀測到相似的特性。

在衣原體肺炎模型中[22]，NOD2和RIPK2對宿主反應極為重要；NOD2-和RIPK2-鼠感染衣原體后，一氧化氮生成減少，以及肺部中性白細胞聚集延遲。NOD1-/-鼠感染梭狀芽胞桿菌中觀測到腸道中性粒細胞募集缺陷，原因可能與CXCL1產物缺乏有關。

有報告稱[23]，NOD1和NOD2通過協同的方式來調節特定病原體的反應。例如，NOD1和NOD2均敲除鼠的炎性因子有顯著降低，且在沙門氏菌定植粘膜組織結腸炎的模型上有增加。而此表型在NOD1-/-和NOD2-/-單獨敲除模型中沒有被觀測到。

Geddes K[23]也報道了NOD1和NOD2的協同作用。與單一基因敲除相比較，NOD1和NOD2都缺乏的鼠更易感染高致死性細菌，且介導的炎性因子水平更低。

另一項研究嗜肺軍團菌的報告顯示[24]，NOD1 和NOD2顯著的促進了炎性反應。與野生型鼠相比，NOD1-/-鼠顯示細菌清除下降、中性粒細胞聚集延緩以及炎性因子下降。與之相反，NOD2-/-鼠中性粒細胞水平和炎性因子上升。然而，在感染的下一個階段，NOD1-/-和NOD2-/-鼠在肺部促炎因子顯著提高 。總之，上述研究指出[25]，雖然NOD1/NOD2/RIPK2信號不是宿主抵御嗜肺軍團菌的決定性因素，但是NOD1 和NOD2在機體識別細菌中起了參與作用。

7 NOD1和NOD2在原蟲感染中的作用

綜上所述，NOD1和NOD2在介導細菌感染方面的作用已被深入研究。而且，通過建立NOD1-/-和NOD2-/-模型鼠也印證了這一點。然而，最近的研究顯示，NOD1和NOD2在宿主抵御寄生蟲感染方面也起到了關鍵作用。

NOD2-/-鼠無法清除弓形蟲感染，且死亡率與MyD88-/-鼠近似。NOD2顯示參與了T細胞固有功能，而不是激活巨噬細胞系統。并且，NOD2-/-鼠不能激活IFN下游產物及促使Th1 淋巴細胞分化。

通過其他細胞內原生寄生蟲的研究，例如伯氏瘧原蟲和克氏錐蟲，表明NOD2不是宿主抵御這些寄生蟲所必須的[26]。相比之下，NOD1在宿主抵御克氏錐蟲過程中發揮了相應的作用。NOD1-/-鼠的巨噬細胞在接受刺激時NF-κB介導的下游炎性因子減少，且在IFN-y出現時限制T.cruzi炎癥失效。即便在血清中細胞因子水平正常的鼠，NOD1-/-鼠也是高度易感染克氏錐蟲，且與MyD88-/-鼠的水平類似。

雖然上述報告顯示NOD1和NOD2可能識別非細菌性病原體，但還需要進一步的研究證實NOD1 和NOD2在缺乏肽聚糖成分中的病原體識別中的作用，以及判定NOD1和NOD2是否對病原體產生受體，或是否參與了其他固有免疫分子的信號通路。

8 討論

NOD1和NOD2蛋白在宿主固有免疫反應中扮演了重要角色。盡管它們對宿主防御外來侵害具有無可爭議的重要性，但其潛在功能下的特定機制尚未明確。本綜述已指出，部分蛋白質只作用于NOD2信號通路，部分蛋白質不僅影響NOD2還影響NOD1信號通路。毋庸置疑，新發現的蛋白質將分為兩類。區分NOD1和NOD2信號通路調節間的異同尤其重要。我們通過掌握影響NOD1或NOD2信號通路的蛋白質所發揮的作用，從而真正明白這兩個相似的受體的信號激活和調節機制的差異。如果我們忽略了這些相關蛋白的作用和功能而只是關注于NOD2和RIP2之間的關系，我們可能會無視它們細微、獨特的調節，從而影響對其作用過程的研究。

NLR可通過信號通路介導炎性因子的大量釋放，并參與組織和器官的損傷。它們激活的免疫應答與臨床上諸多疾病都密切相關，對NOD受體在先天免疫中的重要性的認識得到進一步加深。然而，目前仍有許多問題尚未解決，如NLR的信號轉導更詳細的機制是什么?NOD與RIPK它們之間的聯系從結構上怎么解釋?如何通過阻斷NLR信號通路，以減少病原微生物對機體的炎性損傷? 通過對NOD1和NOD2在免疫功能方面更全面深入的了解，研究干預措施，將為診斷、治療甚至預防感染性疾病、炎癥相關性疾病、自身免疫性疾病等提供新的治療思路。

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[中圖分類號]R392

[文獻標識碼]A

[文章編號]2095-0616（2015）23-49-04

收稿日期：（2015-07-29）

Insights into the research progress of the NOD1 and NOD2 signalling pathway

ZHENG Yuan1AN Li1QIU Jie2SHI Wei3
1.Department of Pediatric,Ji'nan Central Hospital,Ji'nan 250013,China；2.Shangdong University School of Medicine，Ji'nan 250013,China；3.Department of Obstetrics and Gynecology,Ji'nan Central Hospital，Ji'nan 250013,China

[Abstract]NOD-like receptor is a new type of intracytoplasmic inherent immune pattern recognition receptors,which Play an important role in immune response.Once activated,these molecules trigger intracellular signaling pathways that lead to the activation of transcriptional responses culminating in the expression of a subset of inflammatory genes.In this review,we will focus on the role of NOD1 and NOD2 in the recognition and response to intracellular pathogens,including Gram-positive and Gram-negative bacteria,and on their ability to signal in response to nonpeptidoglycan-containing pathogens,such as viruses and protozoan parasites.

[Key words]NOD1;NOD2;Intracellular pathogens;Innate immunity