干細胞移植治療腦出血的關鍵影響因素研究進展

張倩，胡榮，鄭江，馮華

腦血管病已成為威脅人類健康的主要疾病之一，其中腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是致死致殘率最高的腦血管病，90%的幸存者存在不同程度的殘疾，給家庭和社會造成巨大負擔[1]。隨著社會老齡化，ICH患者逐年攀升[2]，但迄今為止ICH尚無有效救治手段，最新的國際多中心臨床試驗顯示手術干預并沒有給患者帶來獲益[3]，ICH研究與救治仍進展緩慢。隨著干細胞理論與技術的發展，干細胞治療已成為ICH治療最有可能突破的新技術。近來臨床前研究表明ICH后移植外源神經干細胞對神經功能恢復是有利的，移植的干細胞可進入宿主，不僅可以提供神經保護作用，還可以分化為神經元和膠質細胞以修復受損部位，顯示了廣闊的應用前景[4]。但是，由于臨床試驗進展較慢，相關研究數據匱乏，而各試驗間又相對獨立，諸如細胞類型、移植時間、移植細胞數量、途徑以及最佳受眾人群干細胞移植治療ICH的各項關鍵因素都沒有一個確切的標準，不利于后續臨床研究的開展。本文對最新的研究進展做了回顧，總結了干細胞移植治療ICH相關因素的研究進展，并就存在的問題進行探討。

1 可移植干細胞的類型

目前用于移植治療的干細胞主要有下面幾個大類，分別是胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）、成體干細胞（adult stem cell，ASCs）和誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）。iPSCs是體細胞通過過表達Oct4、Sox2、Klf4、和c-Myc可回到初始可塑狀態[5]。成體干細胞ASCs被定義為多能干細胞，來自成體內部組織如骨髓、血液、骨骼肌、神經系統和脂肪等，分別有神經干細胞（neural stem cells，NSCs）、永生化細胞系、骨髓源性干細胞、造血干細胞（hematopoietic stem cells，HSCs）；骨髓間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）；內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）；極小胚胎樣干細胞（very small embryonic-like stem cells，VSELs）、胚胎組織外干細胞（extraembryonic stem cells）和其他來源的成體干細胞（脂肪干細胞、牙組織源性干細胞）[6]。各種干細胞各有優缺點如：成體干細胞的優點在于可以自體移植，iPSCs保持了ESCs的優點，但也有局限性，比如生成效率低和致瘤性問題。因此，現階段出于技術和倫理的考慮與其他兩類干細胞相比，成體干細胞更有臨床適用性，但是受限于分化和增殖的能力，使其進一步應用受到一定程度阻礙。具體不同類型的患者使用哪一類干細胞進行移植應該還需要進一步的研究數據來綜合考慮。

2 干細胞移植治療發揮療效的可能機制

關于干細胞移植治療起效的機制，早期研究集中表明移植的干細胞可以分化為各種神經細胞，以替代損傷丟失的細胞，并融入神經組織形成環路，改善神經功能恢復[7]。但后來的許多研究揭示移植的干細胞存活數量和時間有限，如研究發現ICH后在血腫區域很少能找到移植的臍帶血干細胞，腦缺血模型中也發現同樣的現象[8]。后來的研究發現移植的干細胞和前體細胞通過分泌許多細胞因子降低細胞損傷和促進內源性修復而達到神經保護和再生[9]，例如干細胞移植可顯著提高各種營養因子如血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）、膠質細胞源性神經營養因子（glial cell-derived neurotrophic factor，GDNF）、腦源性神經營養因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）、神經生長因子（nerve growth factor，NGF）的水平[10]，顯著發揮抗凋亡和神經營養的作用，降低卒中半暗帶區細胞的死亡，促進神經功能恢復。新近ICH和腦缺血的模型研究發現干細胞移植可顯著活化抗炎因子和抑制促炎因子[9]，有些研究提示多種干細胞如NSCs、CD34+細胞、MSCs移植起效不僅促進神經的修復，還促進支持結構如血管的生成[11]。更有意思的是研究還提示移植干細胞不僅自身參與修復，還促進腦組織內源性神經干細胞的發生[10]。另外，將神經干細胞與T淋巴細胞體外共培養發現NSCs可通過分泌一些因子移植T淋巴細胞的增殖[12]，提示ICH急性期行顱內干細胞移植可能通過影響T淋巴細胞調節大腦和體循環的免疫反應減輕損傷。這些研究表明干細胞與損傷區微環境/腦內源性細胞間相互作用、調節機體的免疫炎癥反應等的機制是多樣的，ICH后細胞治療還需要更加深入的研究來解決上述機制問題，明確干細胞移植治療的起效機制有助于制訂方案，促進療效降低風險。

3 干細胞移植治療的輸注時機與途徑

3.1 適用患者 干細胞治療ICH應用到臨床前需要解決的第一個關鍵問題是：哪些患者適合該療法并能從中獲益？ICH病理學分類和解剖學位置需要重點考慮。另外，還要考慮不同人種、年齡、性別在治療中的差異。目前臨床研究尚缺乏這方面的數據，臨床前的研究主要使用青年雄鼠作為研究對象，但臨床上老年患者才是卒中的主要受害者，因此從臨床前的研究中得到的結論不能完全推論到臨床。同時，以往主要的臨床前和臨床研究都主要集中在缺血性卒中而不是ICH，僅有少數是針對ICH，而且采用的動物模型也缺乏統一[13]，不同的卒中模型，可能導致干細胞治療產生的遠期療效不一樣。例如有臨床前研究對比發現對紋狀體梗死進行干細胞移植比皮層缺血性卒中的應用效果更明顯[14]。此外，設計臨床試驗時尚需要考慮患者的穩定性和并發癥情況，特別是大面積梗死患者，常伴有多種并發癥（吸入性肺炎，心律不齊等），這會影響干細胞移植的效果。因此，目前的臨床前和臨床研究尚無確切證據提示哪些ICH患者更適合干細胞治療，后續研究需要就這個問題進行探討。

3.2 時機 最適合進行移植的時機尚不確定，表1總結了目前ICH后干細胞移植治療方面的臨床前研究，發現干細胞移植時間從卒中早期24 h到1個月后不等。有學者提出如果治療目標側重神經保護機制應該更多考慮急性期移植；如果治療目標在于促進修復和抑制神經元凋亡應該考慮亞急性期移植；炎癥消退后對使用新神經元環路直接替代損傷組織的神經修復途徑更為有利，這個策略需要卒中后幾周到幾月更佳[15]。一項大鼠研究表明靜脈注射骨髓間充質干細胞后24 h和72 h神經功能有顯著改善，但是7天后效果不顯著[16]。另一項動物研究比較了在急性期、慢性期分別給予干細胞治療，但得出矛盾結果[17]，慢性期給藥治療效果反而優于急性期。由于這類似的臨床前研究太少，同時又缺乏相應的臨床數據，因此，ICH后移植的最佳時間目前還不能確定，需要進一步的研究來探明。

3.3 途徑 干細胞移植的最佳途徑也不確定，現有研究顯示直接顱內移植、靜脈以及動脈注射都能改善卒中患者的神經功能預后[18]，但每條途徑都存在安全問題。靜脈注射作為一個全身循環給藥途徑，與直接腦部注射相比，安全，但輸送到目標部位量少，也可能產生微栓塞[10]。臨床前研究中靜脈注射移植干細胞時使用免疫抑制劑并不能改善行為結局；頸內動脈直接給藥可以避免首關效應，且侵襲性小于腦實質直接移植，而效果優于靜脈注射移植[19]，但由于這類途徑移植的數據太少，暫無法得出其是否安全可靠的結論；而腦實質移植更具有創傷性，可能擾亂相關腦組織，并且這個部位被認為是沒有營養支持的炎癥環境[10]。顱內注射的部位也有待商榷，實驗表明細胞直接移植到病灶中，不能達到預期成活率，相反若移植的細胞與病灶保持一定的距離則能很好的成活。可能的機制是移植干細胞的存活和分化需要各種細胞因子的營養、微環境的平衡及一定的血液供應。因此，理論上最適合的注射部位應在梗死或出血灶的周邊半暗帶區。但由于供體細胞和內源性祖細胞之間的相互作用、局部微環境對細胞遷移及可塑性的影響使得最佳位置仍不確定，需要進一步的研究。此外顱內注射特別是對急性缺血性卒中患者時，使用全身麻醉也是一個問題。具體選用哪一種移植途徑還需要更多更確切的臨床數據來驗證。

3.4 細胞數量 目前臨床試驗數據很少，也沒有確切的研究表明該采用何種劑量，劑量過低不利于達到治療效果而劑量過高將造成浪費，為避免無效移植或高濃度導致的靜脈栓塞，需要確定劑量的上下限[20]。人神經元樣細胞（ntera2/D1 neuron-like cells，NT2N）是最早應用于臨床研究的細胞，在試驗時分別使用了2×106和6×106兩個細胞數量，結果顯示高細胞數量能夠更好地改善神經功能[10]。后續臨床試驗使用不同種類的干細胞給藥途徑和細胞數量都沒有固定的標準，從已有的實驗數據看，使用BM-MNC劑量最高可達3×107而最低劑量是使用MSC時僅用5×105[1]，腦部直接注射的劑量在10 000左右；靜脈或動脈注射劑量是其10倍。

3.5 干細胞移植新策略-聯合移植 另外一種聯合策略是一種干細胞聯合另一種非干細胞，非干細胞底物來增強移植治療效果，比如聯合應用NSCs和內皮細胞明顯增加干細胞的存活和分化[21]。聯合移植治療的方法比較新穎，已經表現出增強干細胞存活降低不良反應的能力，值得深入探索。

3.6 追蹤被移植干細胞 dMR研究可以用來評估新血管形成，正電子發射型計算機斷層顯像可以評估新陳代謝變化，擴散張量成像用于評估神經纖維束的完整性[22]，而功能磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）評估神經可塑性[23]。因此聯合影像模式有可能更好的全方面評價被移植細胞以此弄清楚它們的作用機制。

4 干細胞治療的臨床試驗

細胞治療為卒中開辟了一個新的治療途徑，但將干細胞治療的動物實驗轉化到臨床應用還存在著很多挑戰。2007年，美國國立衛生研究院（National Institutes of Health，NIH）通過名為“干細胞療法作為卒中治療緊急范例（Stem Cell Therapies as an Emerging

Paradigm in Stroke，STEPS）”的決議，是基于標準化研究為目的，決定從動物實驗轉入臨床試驗。2010年舉行了名為STEPS2的第二次會議，為以后基于干細胞的研究制定了新的指南[18]。將來如何促進干細胞與患者的神經系統相融合以促進神經功能恢復是大家所關注的。目前的單臂臨床試驗研究表明干細胞移植治療卒中是有效的，但也發現移植以后出現一定比例的感染（15%）、癲癇（14%）和死亡（13%）（http://www.clinicaltrials.gov）[1]（表1）。臨床數據同時表明：短期（6個月）觀察比長期（12個月及以上）觀察得到的結果更有效，骨髓源性單核細胞注射比其他干細胞類型更有效，動脈內注射比其他途徑有效，高劑量優于低劑量[24]。因此，未來的研究需要遵照報告實驗指南綜合標準（Consolidated Standards of Reporting Trials guidelines，CONSORT）這一指南施行，否則錯誤的實驗設計會極大影響實驗結果。基礎科學家和臨床醫生共同參與制定的一篇中樞神經系統干細胞移植的指南也很重要[18]。

表1 臨床研究[1]

每年將近1.6億人發生卒中，導致約6百萬人死亡[1]，而治療手段卻極其有限。目前干細胞治療被認為是非常有前景的療法，最近一項臨床前實驗的Meta分析結果表明不同類型干細胞經顱內、動脈內以及靜脈注射給藥后有結構和（或）功能上的恢復。盡管干細胞移植治療腦出血的臨床前研究令人鼓舞，仍然有很多問題不甚明了，諸如細胞激活機制和最佳處理程序以及這些處理的效果，移植后在病理環境下生存、分化和維持獲得表型的能力，以及對被移植大腦的影響。同時注射時間與持續時間長短也帶來一定不同效果。所以在干細胞的鑒定、特性和準備方面需要進一步研究來證實干細胞移植在腦卒中方面的確切療效與安全性問題，以及隨機大樣本的前瞻性臨床試驗來解決最佳細胞類型、劑量、時機和給藥途徑等問題。

1 Jeong H, Yim HW, Cho YS, et al. Efficacy and safety of stem cell therapies for patients with stroke:a systematic review and single arm meta-analysis[J]. Int J Stem Cells, 2014, 7:63-69.

2 Sullivan R1, Duncan K, Dailey T, et al. A possible new focus for stroke treatment-migrating stem cells[J].Expert Opin Biol Ther, 2015, 15:949-958.

3 Mendelow AD, Gregson BA, Rowan EN, et al.Early surgery versus initial conservative treatment in patients with spontaneous supratentorial lobar intracerebral haematomas (STICH Ⅱ):a randomised trial[J]. Lancet, 2013, 382:397-408.

4 Qin J, Gong G, Sun S, et al. Functional recovery after transplantation of induced pluripotent stem cells in a rat hemorrhagic stroke model[J]. Neurosci Lett, 2013,554:70-75.

5 Nam H, Lee KH, Nam DH, et al. Adult human neural stem cell therapeutics:Current developmental status and prospect[J]. World J Stem Cells, 2015, 7:126-136.

6 Shinozuka K, Dailey T, Tajiri N, et al. Stem cell transplantation for neuroprotection in stroke[J]. Brain Sci, 2013, 3:239-261.

7 Locatelli F, Bersano A, Ballabio E, et al. Stem cell therapy in stroke[J]. Cell Mol Life Sci, 2009, 66:757-772.

8 Stroemer P, Patel S, Hope A, et al. The neural stem cell line CTX0E03 promotes behavioral recovery and endogenous neurogenesis after experimental stroke in a dose-dependent fashion[J]. Neurorehabil Neural Repair, 2009, 23:895-909.

9 Lee ST, Chu K, Jung KH, et al. Anti-inflammatory mechanism of intravascular neural stem cell transplantation in haemorrhagic stroke[J]. Brain,2008, 131:616-629.

10 Banerjee S, Williamson DA, Habib N, et al. The potential benefit of stem cell therapy after stroke:an update[J]. Vasc Health Risk Manag, 2012, 8:569-580.

11 Taguchi A, Soma T, Tanaka H, et al. Administration of CD34+cells after stroke enhances neurogenesis via angiogenesis in a mouse model[J]. J Clin Invest, 2004,114:330-338.

12 Hu S, Rotschafer JH, Lokensgard JR, et al. Activated CD8+ T lymphocytes inhibit neural stem/progenitor cell proliferation:role of interferon-gamma[J]. PLoS One, 2014, 9:e105219.

13 Hicks AU, MacLellan CL, Chernenko GA, et al. Longterm assessment of enriched housing and subventricular zone derived cell transplantation after focal ischemia in rats[J]. Brain Res, 2008, 1231:103-112.

14 Smith EJ, Stroemer RP, Gorenkova N, et al.Implantation site and lesion topology determine efficacy of a human neural stem cell line in a rat model of chronic stroke[J]. Stem Cells, 2012, 30:785-796.

15 Meamar R, Dehghani L, Ghasemi M, et al. Stem Cell Therapy in Stroke:A Review Literature[J]. Int J Prev Med, 2013, 4:139-146.

16 Yang B, Strong R, Sharma S, et al. Therapeutic time window and dose response of autologous bone marrow mononuclear cells for ischemic stroke[J]. J Neurosci Res, 2011, 89:833-839.

17 Darsalia V, Allison SJ, Cusulin C, et al. Cell number and timing of transplantation determine survival of human neural stem cell grafts in stroke-damaged rat brain[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2011, 31:235-242.18 Savitz SI, Chopp M, Deans R, et al. Stem Cell Therapy as an Emerging Paradigm for Stroke (STEPS)Ⅱ[J]. Stroke, 2011, 42:825-829.

19 Fischer UM, Harting MT, Jimenez F, et al. Pulmonary passage is a major obstacle for intravenous stem cell delivery:the pulmonary first-pass effect[J]. Stem Cells Dev, 2009, 18:683-692.

20 Andres RH, Guzman R, Ducray AD, et al. Cell replacement therapy for intracerebral hemorrhage[J].Neurosurg Focus, 2008, 24:E16.

21 Zhang W, Yan Q, Zeng YS. Implantation of adult bone marrow-derived mesenchymal stem cells transfected with the neurotrophin-3 gene and pretreated with retinoic acid in completely transected spinal cord[J].Brain Res, 2010, 1359:256-271.

22 Nakagomi N, Nakagomi T, Kubo S, et al. Endothelial cells support survival, proliferation, and neuronal differentiation of transplanted adult ischemiainduced neural stem/progenitor cells after cerebral infarction[J]. Stem Cells, 2009, 27:2185-2195.

23 Bliss TM, Andres RH, Steinberg GK. Optimizing the success of cell transplantation therapy for stroke[J].Neurobiol Dis, 2010, 37:275-283.

24 Barbosa da Fonseca LM, Gutfilen B, Rosado de Castro PH, et al. Migration and homing of bone-marrow mononuclear cells in chronic ischemic stroke after intraarterial injection[J]. Exp Neurol, 2010, 221:122-128.

【點睛】

本文分別對影響干細胞治療的細胞數量、移植時間、最佳給藥途徑等關鍵問題展開闡述，以供后續研究參考。

中國卒中學會誠聘醫學期刊編輯

中國卒中學會是民政部登記成立的國家學術社團單位，現因工作發展需要，誠招醫學期刊編輯若干名。

一、待遇：

1、薪酬從優（面議）；五險一金；年終獎；節假福利等。

2、享受全部國家規定的帶薪假及單位額外帶薪假。

二、基本條件：

1、臨床醫學（西醫）專業本科及以上學歷，有神經科背景優先；

2、有英文專業閱讀能力，能夠檢索、翻譯中英文獻，并有良好的文字編輯能力；

3、能熟練使用電腦和常用辦公軟件及設備；

4、工作細致、責任心強，有團隊合作精神，性格適合做編輯工作。

三、崗位職責：

從事雜志社學術期刊稿件的審核、編輯、校對工作。

了解學會：www.chinastroke.net

聯系方式：王老師；010-57986266；wangfeng@chinastroke.net