我國水牛繁殖生物技術研究進展

李婥 楊春艷尚江華 鄭海英 黃芬香

（中國農業科學院廣西水牛研究所，農業部（廣西）水牛遺傳繁育重點實驗室 530001）

我國水牛繁殖生物技術研究進展

李婥 楊春艷*尚江華 鄭海英 黃芬香

（中國農業科學院廣西水牛研究所，農業部（廣西）水牛遺傳繁育重點實驗室 530001）

水牛適應和抗病力性強、耐高溫高濕、耐粗飼、易飼養、使用年限長，非常適合我國南方的飼料資源和氣候條件，而且水牛奶營養豐富，現今我國正致力于發展水牛奶業。引入的河流型水牛，體格大，生長快速，產奶量高，與本地水牛雜交后代的奶水牛產奶量達到1200～2000kg，可顯著提高本地水牛的產奶性能。但由于水牛的繁殖性能低下，我國水牛雜交改良面臨著良種種源匱乏的問題，要突破這個瓶頸，必須集成現代動物繁殖技術（如人工授精、超數排卵、體外胚胎生產、核移植、轉基因和胚胎移植等技術），以提高水牛的繁殖效率和種源供應能力，從而促進我國水牛品種改良和水牛奶業開發。近年來，圍繞水牛繁殖生物技術已開展了大量的研究，下面就此作一綜述。

1 超數排卵和同期發情

一般母牛每次發情只排一個卵。人們通過使用外源激素，能使母牛一次排多個卵以生產多個胚胎，并通過胚胎移植加快優良母畜基因型的擴散。水牛卵巢上原始卵泡數分別比奶牛低30%，卵泡閉鎖率較奶牛高，且水牛對超排藥物的反應力低，個體反應差異大，因此胚胎回收率遠低于奶牛。近年來，水牛的胚胎回收率雖已有很大提高，可用胚胎可高達2.5～3.0枚，但大多數仍在1.0～2.0枚范圍內。

常用于水牛超排的促性腺激素有PMSG（孕馬血清促性腺激素）和FSH（促卵胞素）。PMSG和FSH用于水牛超排處理的反應已有很多試驗研究，幾乎所有的實驗結果都表明FSH（總劑量為30～50mg）的超排效果優于PMSG（總劑量為2000～3000國際單位），每次超排獲得有效胚胎的數量是2.09比0.56[1-2]。

同期發情技術可便于掌握適時輸精，縮短發情配種時間，有利于提高人工授精配種受胎率和胚胎移植受胎率。近年來，國內對水牛同期發情技術的應用做了一些研究，已發展了多種同期發情方法用于誘導水牛的發情和排卵，如孕酮法、兩次PGF2α法等。研究表明通常有優勢卵泡和黃體存在時處理成功率較高；在繁殖季節同期發情的效果較好；在乏情季節，結合使用孕酮可提高受胎率。

蔣如明等（2003）應用孕酮陰道栓結合氯前列烯醇（CIDR+PGc）誘導本地母水牛同期發情，同期發情率高達85.13%，單獨應用氯前列烯醇（PGc）或孕酮陰道栓（CIDR），同期發情率也分別達到64.18%、73.01%。而和占星等（2005）運用國產氯前列烯醇處理云南水牛的胚胎移植試驗時，供、受體的同期發情率均較低，只有43.33%。

2 水牛胚胎體外生產

胚胎體外生產（Invitroproduction，IVP）包括卵母細胞體外成熟（Invitromaturation，IVM）、 體外受精（Invitrofertilization，IVF） 和體外胚胎培養（Invitroculture，IVC)。通過IVP可大量生產良種胚胎，是解決水牛品種改良過程中胚胎來源困難的一條有效途徑。Madan等1991年獲得世界上第一頭體外受精水牛犢，我國于1993年獲得第一頭體外受精水牛犢。

胚胎體外生產的卵母細胞來源主要分為屠宰場卵巢和活體采卵（Ovumpick-up，OPU）。屠宰場卵巢容易獲得，但由于系譜不明確，且絕大部分為沼澤型水牛卵巢，因此對水牛品種改良的意義不大。OPU通過B型超聲波引導，經子宮壁采集卵母細胞，可重復從遺傳價值高的水牛采集卵母細胞，其與體外受精技術相結合可生產大量系譜明確的胚胎，從而充分利用優良母畜的遺傳潛力。OPU與體外胚胎生產技術相結合，生產的可移植胚胎為超數排卵的2～3倍，每頭供體每月可生產更多的可移植胚胎（2.0±0.6枚），并可克服母畜生殖道疾病對胚胎質量的影響[3-6]。

近二十年來，水牛體外胚胎生產取得了較大的進步，但生產效率仍然較低。國內所報道的水牛卵母細胞的成熟率、卵裂率和囊胚率分別為51.7～80%、52.7～60%和18.5～28.8%。關于水牛活體采卵-胚胎體外生產目前主要在廣西水牛研究所開展，黃右軍等（2004）經活體采卵平均每頭次獲可用卵母細胞3.18±2.89枚，采集的可用卵母細胞以MC和SOF兩種系統培養，受精分裂率和囊胚率分別為45.2%、30.6%和70.8%、18.8%[6]。黃芬香等（2009）比較了不同季節的活采效果，發現季節之間卵母細胞可用率和受精卵分裂率沒有差異，但秋冬季的囊胚率（27.09%）則明顯高于春季的20.95%和夏季的20.45%[5]。

水牛的成熟培養系統一般為含10%FBS的TCM199液中添加促性腺激素FSH、LH、類固醇激素E2、表皮生長因子（EGF）和硫醇類化合物β-巰基乙醇。水牛體外受精液中多添加肝素和咖啡因，而王啟勝等（2001）在受精液和早期胚胎培養液中添加輸卵管上皮細胞+顆粒細胞或牛磺酸，囊胚率分別為28.1%和20%，均極顯著高于對照組。水牛受精卵的體外囊胚發育率在多數實驗中都只達15～30%，在培養水牛胚胎時除了少數研究使用化學成分明確的培養基外，大多數仍采用含有血清和體細胞的復雜培養液，并發現飼養層細胞有助于促進胚胎越過8～l6細胞期阻滯。在胚胎培養液中加入IGF-l、胰島素、重組BSA、EGF和ITS可提高囊胚發育率 [7]。

3 水牛胚胎移植

胚胎移植是水牛超數排卵、體外受精、體細胞核移植的最終環節，對良種水牛的擴繁具有重要意義。胚胎移植首先要解決供體母牛與受體母牛發情同期化問題，常用的方法與供體母牛情期同期化處理基本一樣，受體母牛注射兩次PG或其衍生物，使注射間隔時間l1d。由于水牛黃體突出表面不明顯，難以觸診，給胚胎移植準確到位造成一定困難。母水牛子宮頸在發情后不久就處于基本閉鎖狀態，使輸胚管插入困難并容易造成子宮損傷，影響胚移受胎率。為了提高受胎率，選用已產2胎以上的母牛作為受體母牛較好[8]。

目前水牛鮮胚移植受胎率一般只有6～l3%，個別試驗受胎率達到33.7～66.7%，胚移受孕水牛3個月內流產比較嚴重，流產率有時達到40～50%。黃右軍等（2002）由2頭經超數排卵處理的母水牛，授精后第5d非手術回收3枚囊胚，說明受精卵在體外發育速度比在體內發育慢，推測試管水牛胚胎移植的適宜時間，應是受體母牛站立發情后第4～6d。黃右軍等（2004）在受體母牛發情后第4～6d進行胚胎移植，結果鮮胚受胎率：第4d為48.1%，第5d為28.0%，第6d為31.3%，平均為36.2%，說明在此段時間移植6～8d的體外胚胎（囊胚）是適宜的。以每頭次2枚體外胚胎（鮮胚或凍胚）移植受體母牛，鮮胚移植受胎率為36.2%，產下21頭試管水牛；凍胚移植受胎率為20.0%，產下3頭凍胚試管水牛[8]。

4 水牛胚胎冷凍

胚胎冷凍技術可突破時間和空間的限制，解決胚胎生產與移植在時間和地域方面的矛盾，實現水牛胚胎本地生產異地移植，還可長時間保存優良種水牛的遺傳資源，便于胚胎運輸，促進水牛繁殖生物技術的推廣應用。1990年，Misra首次采用程序化冷凍獲得了水牛凍胚移植成功。在我國，石德順等于1999年成功獲得首例受精卵冷凍保存的試管牛。張秀芳等（2007）采用甘油對體外受精胚胎進行程序化冷凍，解凍后凍胚成活率達到了73.4～75.0%[6]。

盡管以上研究已驗證了水牛胚胎冷凍的可行性，但水牛胚胎的冷凍還沒得到廣泛的應用。

5 水牛性別控制

使用性別控制技術進行繁育奶水牛的效率將比無性別控制的提高近一倍，對加速繁殖良種水牛，解決制約我國水牛奶業的發展瓶頸——良種水牛缺乏，推動中國水牛奶業發展具有重大的現實意義。目前，實現家畜性別的人為控制主要有兩個途徑：一是X精子和Y精子的分離；二是早期胚胎的性別鑒定。

自2004年開始，廣西大學專家將牛的精子分離后進行人工授精，產下母水牛的成功率94%，公水牛的成功率是91%。盧克煥等（2006）使用流式細胞分類儀分離X、Y精子，準確率達到90%以上，分離的精子用于體外受精，生產的胚胎移植后產下經XY精子性別控制的雌雄水牛雙犢[9]。

關于胚胎的早期性別鑒定，武建中等（2006）報道通過連續多重PCR方法擴增公牛特有的Sry基因以及公母水牛共有的水牛1.715衛星DNA序列，能夠有效的對水牛早期胚胎進行性別鑒定[10]。

6 水牛體細胞核移植及轉基因研究

體細胞核移植在短期內可大量復制具優良基因的動物個體，并為轉基因技術研究提供基礎。水牛的體細胞核移植研究開始較晚，石德順等人于2005年報道了首例水牛體細胞克隆牛犢的誕生[16]。核移植操作復雜，影響因素多，針對水牛體細胞核移植的供體細胞類型、供體細胞處理方法開展了大量的研究，這些研究都表明采用顆粒細胞（囊胚率為9.8～22.5%）和胎兒成纖維細胞（囊胚率為8.7～31.45%）的核移植效率好于耳成纖維細胞（囊胚率為7.0～10.9%）；采用細胞處理可提高核移植效率，最佳處理方法為阿菲迪霉素和血清饑餓聯合處理（囊胚率為21.3～31.45%），其效果要好于單獨的血清饑餓法（囊胚率為7.6～10.6%）和接觸抑制法（囊胚率為 8.7～9.5%）[12-13]。

陸鳳花（2005）探討了電融合參數對水牛體細胞核移植效果的影響，最適宜的電融合參數為100V/mm，15μs，3次電脈沖；將來自一頭22歲摩拉公牛耳皮膚成纖維細胞的胚胎移植后，妊娠到第215d[14]。石德順等（2007）采用阿菲迪霉素和血清饑餓聯合處理可有效將體細胞同步于G0/G1期，核移植重構胚的囊胚率為21.3～22.2%；將42枚胚胎移植入21頭受體，4頭妊娠，產出并存活世界第一頭克隆水牛犢 [11]。

轉基因技術是基因工程和胚胎工程結合的一門生物技術。轉基因動物生產是使用轉基因工程技術將選定的目的基因導入動物染色體組，并整合表達和遺傳的過程。通過轉基因克隆的方法對水牛進行定向遺傳改良和研發高效乳腺生物反應器，可解決我國水牛奶業開發面臨的水牛繁殖率低和產奶量低等問題，提高水牛的經濟價值。

董克家等（2003）構建人FSHβ乳腺定位表達載體Plxin-hFSHβ，通過精子載體法，獲得一頭轉基因水牛犢，并通過T-A克隆和測序分析檢測了人FSHβcDNA整合情況。韋精衛等（2008）以含neo和GFP基因雙標記的水牛、黃牛胎兒成纖維細胞進行牛轉基因體細胞核移植，所構建的重組胚，2-細胞階段觀察不到GFP的表達，4-細胞以后GFP的表達逐漸增強，在囊胚的內細胞團和滋養層細胞均可檢測到GFP的表達，將黃牛同種轉基因克隆囊胚進行移植，獲得1例妊娠；并且異種核移植重組胚中可檢測到GFP表達，GFP可作為異種核移植胚胎來源的一種新標記，為下一步的轉基因克隆水牛生產奠定基礎[15]。

7 存在問題

（1）超數排卵和同期發情的效率仍然較低，需要制訂中長期的研究計劃，探討水牛卵泡發生和繁殖內分泌規律，找出有效的發情鑒定方法。體外胚胎生產雖然也取得一些成績，但實質上仍處于研究階段，還未能真正應用于生產。今后應降低胚胎體外生產的成本，提高體外成產效率。

（2）水牛胚胎冷凍缺乏系統研究，還未能建立一套適合于水牛的胚胎冷凍程序。

（3）體細胞核移植操作條件要求高，且需要高昂的儀器設備，不能在基層應用，急需建立簡單高效的徒手克隆技術體系。

（4）水牛轉基因的研究開展較晚，目前研究成果還缺乏。

8 結語

水牛的繁殖受氣候和季節的影響大，發情征兆不明顯給發情鑒定帶來一定困難、發情間隔時間長、受胎率低，這些因素制約著水牛的繁殖力。盡管如此，通過科研人員對水牛繁殖內分泌學的研究，以及對水牛人工授精、胚胎移植、體外受精、胚胎冷凍等生物技術的研究，使水牛繁殖性能的提高呈現了希望。隨著幼畜超數排卵技術（Juvenile In Vitro Embryo Transfe，JIVET）、核移植、轉基因等新興生物技術在水牛上的研究，相信將來水牛的遺傳潛力會得到更好的發掘，水牛奶業也將得到快速發展。

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廣西自然科學基金（2013GXNSFBO018045）。

李婥（1979-），女，廣西人，學士，實習研究員。

*通訊作者：楊春艷（1972-），女，副研究員，研究方向：主要從事動物遺傳育種與繁殖研究。