A型流感病毒致病分子機制及禽流感診斷

沙德軍（四川省鹽邊縣紅果彝族鄉畜牧獸醫站 617100）

焦萬洪（四川省鹽邊縣農牧局畜牧站 617100）

李莉（四川省鹽邊縣桐子林鎮畜牧獸醫站 617100）

A型流感病毒致病分子機制及禽流感診斷

沙德軍（四川省鹽邊縣紅果彝族鄉畜牧獸醫站 617100）

焦萬洪（四川省鹽邊縣農牧局畜牧站 617100）

李莉（四川省鹽邊縣桐子林鎮畜牧獸醫站 617100）

禽流行性感冒是由A型流感病毒引起的從呼吸系統病變到全身敗血癥的一種高度急性傳染病，對養禽業造成了巨大的損失。

1 禽流感病毒感染和致病的分子機制

1.1 吸附、穿膜和脫殼

病毒粒子血凝素突起識別和結合宿主細胞表面含唾液酸的特異性受體，使病毒與宿主細胞接觸并吸附到細胞膜上，然后被吞入，形成胞飲泡，胞飲泡與溶酶體融合使胞內pH降到5，病毒粒子血凝素蛋白構型改變使位于輕鏈HA2N端的融合序列暴露，引起病毒囊膜與細胞膜融合，使病毒粒子內部的核衣殼釋放到胞漿內。

1.2 基因組的轉錄與復制

病毒脫去囊膜后其核酸片段進入宿主細胞核。首先，病毒RNA聚合酶結合到宿主mRNA的5′端，通過聚合酶組分2的核酸內切酶活性切下11個核苷酸，這一序列帶有帽狀結構，可直接作為引物。引物加上后，聚合酶組分1以病毒RNA為模板催化合成起始，并使鏈延伸。接上去的第一個核苷酸是G，它與病毒RNA聚合酶的3′端第二個核苷酸互補，病毒轉錄酶不轉錄3′端的第一個核苷酸（U）。當鏈延伸到14個核苷酸長度時，引物被釋放下來，但3′端的A仍保留在mRNA上，病毒mRNA的5′端仍為AGC。當鏈延伸到近5′端的poly（U）時，以此為模板合成poly（A）尾后終止鏈的延伸。因此，病毒mRNA是病毒RNA的不完全轉錄物。6個單順反子mRNA在核內合成后，很快轉移到細胞漿翻譯病毒蛋白。

1.3 病毒蛋白的合成

mRNA在核內合成后轉移到細胞漿，在核糖體上翻譯成為病毒血凝素、神經氨酸酶、核蛋白、聚合酶組分1、聚合酶組分2和聚合酶組分PA。NS和M基因的mRNA分別進行剪接，各產生兩個mRNA，翻譯成非結構蛋白NS1、NS2，和基質蛋白M1、M2。血凝素HA和神經氨酸酶NA在粗面內質網內進行糖基化，在高爾基體中修飾后運輸到細胞膜。

1.4 病毒粒子的裝配

首先，HA和NA插入到細胞膜，然后M1移向細胞漿膜的內側面，非連續地貼補使之增厚。NP在細胞漿合成后首先以游離狀態存在，但很快進入細胞核并與新合成的vRNA結合形成核衣殼。8個基因節段和內部病毒蛋白（NP、PB1、PB2、PA、M2）一起組裝，并移送到有HA、NA和M2插入的細胞膜位置，準備出芽。

1.5 病毒的出芽和釋放

這個過程可持續數小時而不溶解感染的細胞，目前機制尚不清楚。M1合成后到達細胞膜并與HA、NA或M2的胞漿區之間相互作用可能是出芽的信號。NA去除病毒囊膜上的唾液酸，避免子代病毒在細胞膜上的吸附聚集，從而促進病毒粒子的釋放。病毒成熟的最后一步是靠宿主的蛋白酶將HA裂解為HA1和HA2，使病毒粒子具有感染性并進入新一輪的復制，這個裂解過程可能在胞外完成。

2 禽流感的診斷

因為禽流感亞型眾多，毒力差別很大，臨床癥狀也千差萬別，高致病性禽流感除了具有大流行的特點外，很難與其它傳染病區分，因此單靠臨床診斷常常難以定性。AIV的確切診斷有賴于病毒的分離和鑒定。

2.1 病毒的分離

病毒通常在消化道內復制，所以一般從活禽或死禽的氣管和泄殖腔中分離病毒。消化道和呼吸道的組織、分泌物、排泄物也都適合于分離病毒。在高致病性AIV造成全身感染的條件下，由于嚴重的病毒血癥，實際上每一器官都能分離到病毒。

臨床上分離病毒的方法常用棉拭子取氣管和泄殖腔內的分泌物，再將棉拭子放在含有抗生素的平衡鹽溶液中，以抑制細菌生長。雞胚接種是目前分離病毒的常用方法。也可收集器官并放在滅菌的小瓶中，在對器官進行取樣時，應盡量把不同臟器的樣品分別收集，因為從內臟器官分離到流感病毒通常意味著全身感染，這常與致病性高致病性禽流感有關。

2.2 病毒的鑒定

用雞紅細胞檢測雞胚尿囊液的血凝活性是鑒定禽流感的方法之一，有常量和微量兩種技術。

HA表面抗原亞型的鑒定可在血凝抑制試驗（HI）中用一組目前已知的16種（H1～H16）不同血凝素的抗血清來鑒定HA的亞型。抗HA血清最好用純化的HA蛋白制備，或用單克隆抗體，這樣可以避免由于抗NA抗體所產生的空間干擾。但是，用已知亞型的抗HA抗體不能檢測含有新的HA亞型的流感病毒。血凝陽性的病毒尿囊液還應當與新城疫病毒感染所引起的血凝活性區別。

NA亞型通常用制備的9種已知神經氨酸酶的抗血清做神經氨酸酶抑制試驗（NI）來鑒定。現已經研制出微量NI技術，這有助于對大量分離物的分析，并且易于操作。

對于AIV的毒力鑒定，OIE認為，用1：10倍稀釋具有感染性的雞胚尿囊液，靜脈注射8羽4～8周齡的易感雞，每羽0.2ml，若10d內致死6～8羽，則這樣的流感病毒為高致病性AIV。

2.3 血清學診斷方法

用血清學方法檢測感染雞抗體的存在，一般在病毒感染7～10d后就可以檢測到抗體。常用的檢測抗體的技術包括HI試驗、瓊脂雙擴散試驗（AGIP）、病毒中和試驗、神經氨酸酶抑制試驗（NI）、單輻射溶血試驗（SRD）、放射免疫試驗（RIA）和酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。