藤黃酸對結直腸癌LOVO細胞增殖和血管生成素樣蛋白4表達的影響

魏 建 昌曹杰 楊 平 曾山崎 王成興 邱旭彬 陳華翠

廣州醫科大學附屬廣州市第一人民醫院胃腸外科，廣東廣州510180

藤黃酸對結直腸癌LOVO細胞增殖和血管生成素樣蛋白4表達的影響

魏 建 昌曹杰▲楊 平 曾山崎 王成興 邱旭彬 陳華翠

廣州醫科大學附屬廣州市第一人民醫院胃腸外科，廣東廣州510180

目的研究藤黃酸對結直腸癌LOVO細胞生長增殖和血管生成素樣蛋白4（ANGPTL4）表達的影響，探討藤黃酸可能的抗腫瘤機制。方法采用不同濃度的藤黃酸干預結直腸癌LOVO細胞，分別于12、24、36 h后應用CCK-8法檢測細胞增殖活性，流式細胞儀檢測細胞周期分布和細胞凋亡情況，Western blot檢測ANGPTL4蛋白表達。結果藤黃酸對結直腸癌LOVO細胞的生長和增殖具有抑制作用，該抑制作用呈現濃度依賴性和時間依賴性（P＜0.05）。藤黃酸阻滯LOVO細胞于G2/M期，阻滯作用呈現濃度依賴性（P＜0.05）。高濃度藤黃酸能夠誘導LOVO細胞凋亡（P＜0.05）。藤黃酸抑制LOVO細胞ANGPTL4蛋白表達，ANGPTL4蛋白表達隨藤黃酸作用濃度的增加而減少（P＜0.05）。結論藤黃酸能夠抑制結直腸癌LOVO細胞的生長和增殖，阻滯LOVO細胞于G2/M期，并誘導細胞凋亡，其作用機制可能與抑制ANGPTL4表達相關。

藤黃酸；結直腸癌；ANGPTL4

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是國內外最常見的惡性腫瘤之一，發病率呈逐年上升趨勢，目前位居全球惡性腫瘤第3位[1-2]。術后復發轉移是結直腸癌患者死亡的重要原因，是結直腸癌患者治療的一大難題。結直腸癌發生、發展和侵襲轉移機制仍未明確，其中，腫瘤微血管生成在該過程中有著重要意義[3]。藤黃酸（gambgic acid，GA）是中藥藤黃的活性成分，具有多靶點的抗腫瘤作用，能通過多種機制來發揮作用。本課題組前期研究表明，藤黃酸能夠通過抑制血管新生來抑制結直腸癌的生長和增殖[4-6]。血管生成素樣蛋白4（angiopoietin-like protein 4，ANGPTL4）是新發現的一種分泌蛋白，是血管生成素樣蛋白（angiopoietin-like proteins，ANGPTLs）家族的成員之一，與血管生成、能量代謝及腫瘤生長和轉移密切相關[7-8]。本實驗采用不同濃度藤黃酸作用結直腸癌LOVO細胞，研究藤黃酸對LOVO細胞增殖的影響并檢測ANGPTL4蛋白表達，探討藤黃酸可能的抗腫瘤作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

藤黃酸（98%純度），購自美國Santa Cruz Biotechnology公司，保存于-20℃冰箱。結直腸癌LOVO細胞，貼壁單層生長，40%集落形成率，100%裸鼠致瘤性，由南京凱基公司供應。兔抗人ANGPTL4抗體，購自美國Abbiotec公司。

1.2 方法

1.2.1 LOVO細胞體外培養結直腸癌LOVO細胞放置于37℃，5%CO2培養箱中培養。RPMI1640培養液中加入10%小牛血清、100 U/mL青霉素和50 mg/mL鏈霉素。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞生長、增殖對數生長期LOVO細胞以1×105個/孔數量接種于96孔培養板，培養24 h，去除培養液，加入濃度分別為0、1.0、2.0、4.0 mg/L濃度的藤黃酸溶液，每孔200 μL，各組細胞培養12、24、36 h后，滴加CCK-8液20 μL，孵育1 h，棄上清，酶標儀450 nm波長測定OD值。細胞增殖抑制率（%）=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%。

1.2.3 流式細胞儀分析細胞周期分布及凋亡對數生長期LOVO細胞以每孔1×105個數量接種于6孔培養板，培養24 h，分別加入0（對照組）、1.0、2.0、4.0 mg/L濃度的藤黃酸，繼續培養24 h，離心獲取細胞，PBS液洗滌，70%冷乙醇固定12 h，PBS液清洗去除固定液，離心獲取細胞，RNA酶反應過夜，碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）染色，488 nm激發波長，應用ModFit LT 2.0軟件進行流式細胞儀分析。

1.2.4 Western Blot檢測ANGPTL4蛋白表達分別收集0（對照組）、1.0、2.0、4.0 mg/L濃度藤黃酸處理24 h的LOVO細胞，蛋白裂解液提取蛋白，采用SDSPAGE方法進行電泳，每孔50 pg蛋白，100 V恒壓電泳，轉膜至硝酸纖維素膜，脫脂奶粉封閉2 h，滴加1∶500兔抗人ANGPTL4抗體，搖床振動搖勻2 h，PBST溶液洗滌3次，滴加1∶400兔抗羊IgG-HRP，搖床2 h，PBST洗滌3次，滴加ECL溶液進行顯色、曝光、拍照、掃描，應用Image-Pro Plus軟件分析蛋白灰度。

1.3 統計學方法

應用SPSS 13.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 藤黃酸對LOVO細胞生長和增殖作用

不同濃度藤黃酸作用于LOVO細胞后，呈現不同程度的抑制作用。藤黃酸濃度為0 mg/L（對照組）時，其對LOVO細胞基本無抑制作用，12、24、36 h后抑制率分別為（0.84±1.64）%、（0.98±1.04）%、（1.08±0.68）%；濃度為1.0 mg/L藤黃酸作用LOVO細胞12、24、36 h后抑制率分別為（8.43±1.62）%、（11.81±1.24）%、（29.30± 1.15）%，與對照組相比較，抑制率差異有統計學意義（P＜0.05）；藤黃酸濃度為2.0 mg/L時抑制率分別為（36.74±1.38）%、（49.21±1.08）%、（85.35±1.26）%，與對照組相比較，抑制率差異有統計學意義（P＜0.05）；藤黃酸濃度為4.0 mg/L時抑制率分別為（46.32±1.33）%、（77.92±1.10）%、（98.27±0.74）%，與對照組相比較，抑制率差異有統計學意義（P＜0.05）。表明藤黃酸對LOVO細胞的生長和增殖具有抑制作用，該抑制作用隨著藤黃酸濃度的增加和作用時間的延長而增強，呈現濃度依賴性和時間依賴性。見圖1。

2.2 藤黃酸對LOVO細胞細胞周期構成和凋亡水平的影響

藤黃酸干預LOVO細胞后，其細胞周期的構成發生顯著改變。干預24 h后，藤黃酸濃度為1.0 mg/L時，G2/M期細胞分布較對照組增加，差異有統計學意義（P＜0.05），凋亡率與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；藤黃酸濃度為2.0 mg/L時，G2/M期細胞分布較對照組明顯增加，差異有高度統計學意義（P＜0.01），凋亡率較對照組增加，差異有統計學意義（P＜0.05）；藤黃酸濃度為4.0 mg/L時，（51.21±2.01）%的LOVO細胞阻滯于G2/M期，G2/M期細胞分布較對照組顯著增加，G0/G1期細胞分布顯著減少，兩者比較，差異均有高度統計學意義（P＜0.01），凋亡率較對照組顯著增加，差異有高度統計學意義（P＜0.01）。見表1。

2.3 藤黃酸對LOVO細胞ANGPTL4蛋白表達的影響

0、1.0、2.0、4.0 mg/L濃度藤黃酸分別處理LOVO細胞24 h后，相對分子量45 kD處見ANGPTL4蛋白條帶逐漸變細，其灰度值分別為（812.00±3.04）、（640.00± 2.30）、（446.00±1.46）、（102.00±0.82）DPI。表明藤黃酸抑制LOVO細胞ANGPTL4蛋白表達，且隨著藤黃酸濃度升高，ANGPTL4蛋白表達減少，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

3 討論

結直腸癌是國內外最常見的惡性腫瘤之一，發病率呈逐年上升趨勢，目前位居全球惡性腫瘤第3位[1-2]。術后復發轉移是結直腸癌患者死亡的重要原因，是結直腸癌患者治療的一大難題。結直腸癌發生、發展和侵襲轉移機制仍未明確，其中，腫瘤微血管生成在該過程中有著重要意義[3]。

藤黃是治療腫瘤的一種常見中藥，其來源廣，價格低，副作用少，藤黃酸是其活性成分。近年研究提示，藤黃酸具有多靶點的抗腫瘤作用，能通過多種機制來發揮作用。藤黃酸抗腫瘤作用與常見化療藥物不同，可以選擇性殺死腫瘤細胞，而對人體正常細胞無明顯的毒副作用。本課題組前期研究表明，藤黃酸能夠通過抑制血管新生來抑制結直腸癌的生長和增殖[4-6]。

ANGPTL4是一種分泌蛋白，是血管生成素樣蛋白家族成員之一，與血管生成、能量代謝及腫瘤生長和轉移密切相關[7-8]。朱洪新等[9]研究發現，ANGPTL4能夠通過促進細胞遷移及血管生成，促使膠質瘤C6細胞發生侵襲和轉移。Le等[10]在腎細胞癌研究中發現，ANGPTL4 mRNA和蛋白表達增高。Nakayama等[11]發現，胃腺癌中ANGPTL4表達增加，表示ANGPTL4可能通過促進微血管生成，為腫瘤細胞提供豐富的血液供應，為腫瘤細胞的生長和增殖提供有利的環境和條件。該團隊同時研究結直腸癌中ANGPTL4的表達情況，發現ANGPTL4表達增高并能夠提高腫瘤的侵襲和轉移能力[12]，但未進一步闡述相關作用機制。韓杰等[13]利用shRNA干擾大腸癌HT-29細胞，下調ANGPTL4的表達，發現癌細胞遷移能力受到抑制，提出其可能的機制：ANGPTL4相關信號通路活性降低，影響肌動蛋白快速聚合和解聚，從而抑制細胞的運動和遷移。Zhu等[14]研究認為，ANGPTL4的促腫瘤作用可能是通過誘導和增強由NADPH氧化酶介導的氧化還原反應，改變O2和H2O2之間的比例，為腫瘤細胞提供有利的環境和條件，提高腫瘤細胞活性，增強腫瘤細胞生長、增殖能力，促使腫瘤的進一步發展。

本實驗結果顯示，藤黃酸對結直腸癌LOVO細胞的生長和增殖具有抑制作用，該抑制作用隨著藤黃酸濃度的增加和作用時間的延長而增強，呈現濃度依賴性和時間依賴性。流式細胞儀檢測結果顯示，藤黃酸阻滯LOVO細胞于G2/M期，表示藤黃酸能夠抑制LOVO細胞的DNA合成和有絲分裂[9]，從而抑制LOVO細胞的生長和增殖。隨著藤黃酸作用濃度的升高，G2/M期阻滯比例升高，阻滯作用增強，表明藤黃酸對LOVO細胞周期的阻滯作用呈現濃度依賴性。此外，流式細胞儀結果還顯示，高濃度藤黃酸能夠誘導LOVO細胞的凋亡，濃度為1.0 mg/L時，LOVO細胞凋亡率與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；濃度為2.0、4.0 mg/L時，凋亡率較對照組明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。然而，LOVO細胞總體凋亡率較細胞周期阻滯程度低，提示藤黃酸抑制LOVO細胞生長增殖作用主要與細胞周期阻滯相關。

綜上所述，藤黃酸能夠抑制結直腸癌LOVO細胞的生長和增殖，促進LOVO細胞的凋亡，其作用機制可能是阻滯LOVO細胞于G2/M期，抑制LOVO細胞的DNA合成和有絲分裂，誘導細胞凋亡，并抑制腫瘤細胞ANGPTL4蛋白的表達。藤黃酸是一種極具前景的抗癌藥物，但其確切的作用機制仍需進一步深入研究和探討。

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Effect of gambogic acid on colorectal cancer LOVO cell proliferation and ANGPTL4 expression

WEI JianchangCAO Jie▲YANG PingZENG ShanqiWANG ChengxingQIU XubinCHEN Huacui
Department of Gastrointestinal Surgery,Guangzhou First People's Hospital Affiliated to Guangzhou Medical University, Guangdong Province,Guangzhou510180,China

ObjectiveTo investigate the effect of gambogic acid on colorectal cancer LOVO cells proliferation and the expression of ANGPTL4,discuss the antitumor mechanism of gambogic acid.Methods LOVO cells were cultured with different concentrations of gambogic acid for 12,24 and 36 h in vitro.CCK-8 was used to observe the change in the proliferation of LOVO cells.Flow cytometry(FCM)was applied to analyze cell-cycle kinetics and apoptosis of LOVO cells cultured with different concentrations of gambogic acid for 24 h.Western Blot was applied to detect the protein expression of ANGPTL4.ResultsGambogic acid suppressed the proliferation of LOVO cells in a concentration-dependent and time-dependent manner(P＜0.05).Gambogic acid arrested LOVO cells at G2/M stages in a concentration-dependent manner(P＜0.05).Gambogic acid with high concerntration could induce apoptosis of LOVO cells(P＜0.05). Gambogic acid suppressed the expression of ANGPTL4 protein,the level of ANGPTL4 protein decreased as concentration increased（P＜0.05).ConclusionGambogic acid can inhibit the proliferation of LOVO cells,arrest LOVO cells at G2/M stages and induce apoptosis.The mechanism is related to the suppression of ANGPTL4.

Colorectal cancer;Gambogic acid;ANGPTL4

R735.35

A

1673-7210（2015）04（b）-0004-04

2015-01-03本文編輯：程銘）

國家自然科學資金資助項目（編號81272556）；廣東省科技計劃項目（編號2010B060900016）。

▲通訊作者