VEGF165質(zhì)粒轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞立體定向移植對局灶性缺血大鼠腦血管新生的影響

鄔志堅(jiān) 江慧玲 陳泳暉 劉寧平

廣州市番禺區(qū)中醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東廣州511400

VEGF165質(zhì)粒轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞立體定向移植對局灶性缺血大鼠腦血管新生的影響

鄔志堅(jiān) 江慧玲 陳泳暉 劉寧平

廣州市番禺區(qū)中醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東廣州511400

目的觀察pEGFP-VEGF165質(zhì)粒轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）可否促進(jìn)腦缺血大鼠血管新生。方法全骨髓貼壁法分離獲取第三代BMSCs，當(dāng)BMSCs生長匯合率為80%～90%時(shí)以脂轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)染pEGFP-VEGF165質(zhì)粒。制作大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞（MCAO）模型,分為模型組、BMSCs移植組（BMSCs組）、轉(zhuǎn)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）基因BMSCs移植組（BMSCs/VEGF組）。于造模后7、14、21 d進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分，免疫組織化學(xué)染色檢測腦缺血邊緣區(qū)血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD34和VEGF的表達(dá)，激光共聚焦顯微鏡觀察血管生成情況。結(jié)果BMSCs組與BMSCs/ VEGF組大鼠神經(jīng)功能（BRS）評分較模型組明顯降低（P＜0.01），BMSCs/VEGF組BRS評分低于BMSCs組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與非缺血側(cè)比較，BMSCs組和BMSCs/VEGF組缺血側(cè)微血管直徑、微血管面積均較其顯著增加（P＜0.05或P＜0.01）；BMSCs組和BMSCs/VEGF組微血管直徑、微血管面積均較模型組顯著增加（P＜0.05），但BMSCs組與BMSCs/VEGF組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。7 d時(shí)BMSCs/VEGF組VEGF陽性細(xì)胞較BMSCs組VEGF表達(dá)顯著增加（P＜0.05），其他時(shí)間點(diǎn)兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；BMSCs/VEGF組CD34陽性表達(dá)在各時(shí)間點(diǎn)較BMSCs組有所增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論經(jīng)VEGF基因修飾的BMSCs移植可提高缺血區(qū)血管生成，僅在移植后7 d比單純BMSCs移植VEGF表達(dá)升高有顯著性差異，在神經(jīng)行為學(xué)評分、微血管新生、CD34表達(dá)等方面與單純BMSCs比較，無明顯優(yōu)勢。原因可能與VEGF165質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率不高及腦血管新生機(jī)制復(fù)雜有關(guān)。

血管內(nèi)皮生長因子；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；血管新生

腦梗死具有高發(fā)病率、高病死率、高致殘率的特點(diǎn)[1]，對人類健康危害極大，探索一種治療腦梗死的新方法勢在必行。干細(xì)胞能促使損傷后的神經(jīng)細(xì)胞再生和修復(fù)[2]，但是由于腦血管的閉塞，實(shí)施局部神經(jīng)干細(xì)胞成功移植后，也無法有效建立側(cè)支循環(huán)，使得移植后神經(jīng)干細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)明顯的缺血缺氧狀況而壞死。如何促進(jìn)新血管生成關(guān)系到干細(xì)胞治療急性腦梗死能否成功。骨髓充質(zhì)干細(xì)胞具有多能分化作用，如何定向誘導(dǎo)分化，促進(jìn)腦血管新生是目前研究的難點(diǎn)[3]。本研究擬先將血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）基因轉(zhuǎn)染到骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）中，然后再立體定向移植到缺血的腦組織中，觀察腦血管新生的情況。現(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

無特定病原體（SPF）級SD雄性大鼠，月齡3～4個(gè)月，體重196～235 g,平均（214.6±10.2）g，購自于廣州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：0051622。

1.2 主要儀器與試劑

pEGFP-VEGF165質(zhì)粒購由中山大學(xué)干細(xì)胞研究中心提供。Lipofectamine2000脂質(zhì)體購自于美國Invitrogen公司。質(zhì)粒提取試劑盒購自于北京天根生化科技有限公司。兔抗大鼠VEGF抗體、兔抗大鼠CD34抗體購自于Life Technologies公司。異硫氰酸熒光素標(biāo)記右旋糖酐購自于美國西格瑪奧德里奇中國有限公司。SABC試劑盒、DAB試劑盒，購自于武漢博士德生物工程有限公司。激光掃描共聚焦顯微鏡由德國LEICA公司生產(chǎn)。型號(hào)為41M60032-00032的Image-Pro Plus 6.0圖像分析處理軟件為美國Media Cybernetics公司設(shè)計(jì)。

1.3 方法

1.3.1 BMSCs與VEGF基因轉(zhuǎn)染[4]

取6～8周雄性SD大鼠，取兩側(cè)股骨骨髓，將其制備成單細(xì)胞懸液，將分離獲得的細(xì)胞實(shí)施細(xì)胞，將其接種到L-DMEM培養(yǎng)基，其成分為胎牛血清（FBS），體積分?jǐn)?shù)為0.1。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件如下：37℃、含5%CO2?？捎貌钏儋N壁法對細(xì)胞實(shí)施純化，90%融合時(shí)行傳代培養(yǎng)。取第三代BMSCs進(jìn)行轉(zhuǎn)染，參考篩選優(yōu)化后的轉(zhuǎn)染條件：細(xì)胞密度80%～90%融合度，DNA濃度6.0 μg/mL，DNA∶Lipofectamine 2000（μg∶μL）= 3∶4。轉(zhuǎn)染6 h后，更換含F(xiàn)BS（體積分?jǐn)?shù)為0.1）的LDMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育。轉(zhuǎn)染48 h收集細(xì)胞備用。

1.3.2 MCAO模型建立

對大鼠大腦中動(dòng)脈實(shí)施栓塞術(shù)，2 h后可拔出栓線3～4 mm，進(jìn)行再灌注。MCAO模型的成功條件如下：栓塞后對側(cè)肢體發(fā)生偏癱；行走時(shí)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈。假手術(shù)組建立如下：手術(shù)時(shí)置入栓線，插入頸總動(dòng)脈深度≤0.5 cm，其余操作同上。

1.3.3 分組與用藥

按照腦動(dòng)脈是否閉塞將大鼠分為假手術(shù)組和手術(shù)組，手術(shù)組分為模型組、BMSCs移植組（BMSCs組）、轉(zhuǎn)VEGF基因BMSCs移植組（BMSCs/VEGF組）。各手術(shù)組按照取材時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)分為7、14、21 d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，各組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)例數(shù)為5、5、8只大鼠；假手術(shù)組共大鼠5只。

再灌注24 h后使用立體定位儀在實(shí)驗(yàn)大鼠右紋狀體區(qū)（MR＞2.0 mm，AP＞0 mm，DV＞4.5 mm)細(xì)胞懸液10 μL注射，BMSCs/VEGF組注射含5×105個(gè)轉(zhuǎn)VEGF基因后的BMSCs，BMSCs組注射含5×105個(gè)BMSCs，Model組注射無血清L-DMEM。

1.3.4 標(biāo)本取樣

采用脂法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，細(xì)胞密度為80%～90%，然后觀察VEGF與CD34表達(dá)，行微血管檢測。收集各組大鼠的血管內(nèi)皮細(xì)胞，計(jì)數(shù)1×106血管內(nèi)皮細(xì)胞備用。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 神經(jīng)功能（BRS）評分

使用雙盲法聯(lián)合mNSS評分表對大鼠進(jìn)行綜合評定，內(nèi)容包括肌力、意識(shí)、肌張力、反射、共濟(jì)運(yùn)動(dòng)，以觀察再灌注后大鼠的神經(jīng)功能狀況，測定時(shí)間為用藥后7、14、21 d。

1.4.2 VEGF與CD34表達(dá)

采用免疫組化法檢測，常規(guī)切片、脫蠟、水化后，使用pH 6.0的枸櫞酸鹽緩沖液進(jìn)行熱修復(fù)，然后加入3%過氧化氫，以去除內(nèi)源性過氧化酶的生物活性，用山羊血清進(jìn)行封閉15 min，加入兔抗大鼠VEGF、CD34的一抗，在4℃下過夜，0°C PBS沖洗兩次添加生物素標(biāo)記羊抗兔IgG，在室溫下孵育60 min，加入含辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素溶液，行二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色和蘇木精復(fù)染，經(jīng)酒精梯度脫水后，用二甲苯透明，再用中性樹膠封片。在400倍光鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.4.2.1 VEGF陽性表達(dá)的評定[5]光鏡下觀察，VEGF表達(dá)陽性細(xì)胞會(huì)染色為棕黃色顆粒或團(tuán)塊，且特異性位于細(xì)胞膜或細(xì)胞漿，計(jì)算切片5個(gè)高倍視野中陽性染色反應(yīng)細(xì)胞的百分率。其中無著色為陰性計(jì)0分，淺黃色為弱陽性計(jì)1分，棕黃色為陽性計(jì)2分，棕褐色為強(qiáng)陽性計(jì)3分。

1.4.2.2 CD34陽性表達(dá)的評定[6]光鏡下觀察，CD34陽性細(xì)胞會(huì)染色為褐黃色，其著色部位在血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上，有褐黃色著色的細(xì)胞即可認(rèn)定為血管內(nèi)皮細(xì)胞，計(jì)算切片5個(gè)高倍視野中陽性染色反應(yīng)細(xì)胞的百分率。

1.4.3 微血管檢測

用藥21 d后，使用苯巴比妥給予大鼠麻醉，經(jīng)尾給予大鼠靜注1 mL FITC-Dextran，其含量為50 mg/mL。游離狀態(tài)下，F(xiàn)ITC-Dextran循環(huán)1 min，然后斷頭處死大鼠，將腦半球迅速分離，在4℃下將其放入4%多聚甲醛中固定，時(shí)間48 h，再于4℃下放入20%蔗糖溶液中浸泡過夜。行OTC包埋，冰凍切片，冠狀位下行連續(xù)切片，其切面平面在距前囟-5.8 mm之間與前囟5.2 mm之間，切片間隔為2 mm，厚度為100 μm，取切片5片。在栓塞及對側(cè)的5個(gè)區(qū)域內(nèi)，用激光共聚焦顯微鏡掃描，倍數(shù)為200，發(fā)射波長為522 nm，激發(fā)波長為488 nm，像素為512×512，掃描計(jì)算各個(gè)層面，用Image-Pro Plus 6.0圖像分析處理軟件進(jìn)行分析，觀察微血管的生成情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 16.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠BRS評分

假手術(shù)組動(dòng)物無神經(jīng)功能缺損癥狀，BRS均為0分。缺血再灌注大鼠存在明顯的神經(jīng)功能缺損癥狀，BRS隨時(shí)間變化。移植、VEGF165轉(zhuǎn)染后移植治療后均可明顯降低大鼠BRS評分（P＜0.05），BMSCs/VEGF移植組BRS評分低于BMSCs移植，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 手術(shù)組大鼠腦組織微血管定量分析

2.2.1 微血管直徑

大鼠腦缺血側(cè)的微血管有不同程度的扭曲，增加了血管通透性，F(xiàn)ITC-Dextran可以滲透到血管及周圍組織，而非缺血側(cè)腦血管的供血正常，且結(jié)構(gòu)完整。各治療組缺血側(cè)微血管直徑均較非缺血側(cè)顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，BMSCs組和BMSCs/VEGF組微血管直徑均顯著增加（P＜0.05）；BMSCs/VEGF組與BMSCs組比較，微血管直徑有所增加，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

2.2.2 微血管面積

大鼠腦缺血側(cè)的微血管面積明顯低于非缺血側(cè)（P＜0.05）。BMSCs、BMSCs/VEGF組腦組織微血管面積明顯大于模型組（P＜0.05）；BMSCs組與BMSCs/VEGF組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

2.3 各組大鼠腦組織微血管新生相關(guān)蛋白表達(dá)

2.3.1 VEGF表達(dá)

VEGF在假手術(shù)組無明顯陽性表達(dá)。模型組，7 d時(shí)VEGF陽性表達(dá)最高，14 d時(shí)VEGF陽性表達(dá)下降，21 d最低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；BMSCs組與BMSCs/VEGF組的變化趨勢同模型組。與模型組比較，BMSCs組與BMSCs/VEGF組大鼠VEGF陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)在各時(shí)間點(diǎn)均顯著增加（P＜0.01）；BMSCs組與BMSCs/VEGF組之間比較，7 d時(shí)BMSCs/VEGF較BMSCs組顯著增加（P＜0.05）。見表3。

2.3.2 CD34表達(dá)

CD34在假手術(shù)組無陽性表達(dá)。模型組14 d時(shí)CD34陽性細(xì)胞較7 d顯著減少（P＜0.05），21 d較14 d顯著減少（P＜0.05）；BMSCs組14 d均較7 d顯著減少（P＜0.05）；BMSCs/VEGF組21 d較14 d顯著減少（P＜0.05）。與模型組比較，BMSCs和；BMSCs/VEGF組大鼠CD34陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)在各時(shí)間點(diǎn)均顯著增加（P＜0.01）；BMSCs/VEGF組CD34陽性細(xì)胞較BMSCs組有所增加，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

3 討論

VEGF是相對分子質(zhì)量為45 000的同型二聚體糖蛋白，也是目前為止所發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)有力的血管生成刺激因子，VEGF其可促使細(xì)胞外基質(zhì)分解，從而趨化毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖并形成管腔。研究證實(shí)，腦梗后VEGF的各亞型及受體分別在不同細(xì)胞、不同時(shí)間表達(dá)，有程序地促進(jìn)血管形成[7]。

在大腦缺血治療方法，VEGF有一定功效，但難以穿過血腦屏障，持久效果不佳，因此一直沒有被廣泛推廣應(yīng)用，細(xì)胞轉(zhuǎn)基因移植治療的優(yōu)勢在細(xì)胞可穿過血腦屏障，到達(dá)腦組織所需的位置長期、穩(wěn)定表達(dá)[8]。因此轉(zhuǎn)基因治療一直是腦缺血治療研究的核心。有研究證明血流可促使VEGF基因轉(zhuǎn)染家兔缺血模型缺血區(qū)域血管再生，并最終形成有功能的管腔樣毛細(xì)血管[9]。

本實(shí)驗(yàn)采用脂質(zhì)體介導(dǎo)pEGFP-VEGF165質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs，轉(zhuǎn)染率約為14%，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[10]。進(jìn)一步試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，VEGF165質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs立體定向移植到缺血腦組織后，大鼠的神經(jīng)功能缺損較模型組在14、21 d有顯著減輕（P＜0.05），但與單純的BMSCs移植比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。移植后的微血管直徑、微血管面積、CD34的表達(dá)也顯示了類似的結(jié)果。但是，VEGF的表達(dá)，在移植后第7天BMSCs/VEGF組陽性表達(dá)卻較單純BMSCs移植組有顯著增高（P＜0.05）。隨著治療時(shí)間延長，在14、21 d兩組的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，pEGFP-VEGF165質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs與單純BMSCs移植比較，促進(jìn)新生血管形成和改善神經(jīng)功能方面無明顯優(yōu)勢。分析其原因可能為：脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率太低，僅有14%，下一步可考慮采用腺病毒的方法轉(zhuǎn)染，提高轉(zhuǎn)染效率。學(xué)者采用Ⅰ型單純性皰疹病毒轉(zhuǎn)染VEGF165到BMSCs移植到腦缺血大鼠中，發(fā)現(xiàn)可減輕神經(jīng)功能缺損，促進(jìn)血管新生[11]。另外，血管新生機(jī)制復(fù)雜，需要多種信號(hào)通路共同參與，單一干預(yù)方式難以取效[12-13]。有報(bào)道使用地塞米松、flk-1聯(lián)合轉(zhuǎn)染，可減輕神經(jīng)功能損害，促進(jìn)腦新生血管發(fā)生[14]。量效關(guān)系也是重要的影響因素。經(jīng)VEGF基因修飾的BMSCs在移植部位發(fā)揮分泌VEGF蛋白的作用，具有調(diào)節(jié)免疫、神經(jīng)保護(hù)等作用，需進(jìn)一步進(jìn)行研究，盡早應(yīng)用于臨床，造?；颊?。

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Influence of VEGF165plasmid transfection BMSCs stereotactic transplantation in angiogenesis of focal ischemia rats

WU ZhijianJIANG HuilingCHEN YonghuiLIU Ningping
Department of Neurology,Hospital of Traditional Chinese Medicine of Panyu District in Guangzhou City,Guangdong Province,Guangzhou511400,China

ObjectiveTo observe pEGFP-VEGF165plasmid transfection BMSCs whether promote angiogenesis of focal ischemia rats.MethodsThe third generation of BMSCs were isolated by whole bone marrow adherence method.As BMSCs growth convergence rate reached 80%-90%,pEGFP-VEGF165plasmid transferred by lipid transfer method.Rats were used to make MCAO model,including model group,BMSCs group,BMSCs/VEGF group.Neurological behavior score finished after model 7,14,21 d.Expression of vascular endothelial cell markers CD34 and VEGF were tested by immunohistochemistry staining.Angiogenesis was observed by confocal laser scanning microscopy.ResultsBRS scores in BMSCs group and BMSCs/VEGF group were decreased significantly than those that in model group(P＜0.01),BRS scores in BMSCs/VEGF group were lower than those in BMSCs group,but the difference was not statistically significant (P＞0.05).Compared with non-ischemic side,microvessel diameter and area increased significantly in ischemic side in BMSCs group and BMSCs/VEGF group(P＜0.05 or P＜0.01).Microvessel diameter and area in BMSCs group and BMSCs/VEGF group were higher than those in model group(P＜0.05),but there was no statistically significant difference between BMSCs group and BMSCs/VEGF group.At 7 d,the expression of VEGF and in BMSCs/VEGF group was significantly higher than that in BMSCs group(P＜0.05).There was no statistically significant difference at other time; CD34 expression in BMSCs/VEGF group was higher than that in BMSCs group,but there was no statistically significant difference(P＞0.05).ConclusionBMSCs transplantation modified by VEGF gene can improve angiogenesis in ischemic area,VEGF expression in which have significant difference with pure BMSCs transplantation at post-transplant 7 d. Compared with pure BMSCs at neurological behavior score;angiogenesis;CD34 expression,there are no obvious advantage.Reason may be related to VEGF165plasmid transfection rate low and complex mechanism of brain angiogenesis.

VEGF;BMSCs;Angiogenesis

R743.3

A

1673-7210（2015）04（b）-0011-04

2015-01-05本文編輯：蘇暢）

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)2010B030700049）。