14-3-3η通過抑制內質網應激反應對H9c2心肌細胞的保護作用

王安杏 馬望歌 陳方圓 黃 欣 周 娟 郭 寧▲

1.陜西省寶雞市中醫醫院心血管二科，陜西寶雞721001；2.西安交通大學醫學院第一附屬醫院心血管內科，陜西西安710061

14-3-3η通過抑制內質網應激反應對H9c2心肌細胞的保護作用

王安杏1馬望歌2陳方圓2黃 欣2周 娟2郭 寧2▲

1.陜西省寶雞市中醫醫院心血管二科，陜西寶雞721001；2.西安交通大學醫學院第一附屬醫院心血管內科，陜西西安710061

目的探討14-3-3η通過抑制內質網應激對異丙腎上腺素（ISO）誘導的H9c2心肌細胞損傷的保護作用。方法構建pFLAG-14-3-3η重組表達載體轉染H9c2心肌細胞，使用ISO建立心肌細胞損傷模型。將培養的H9c2心肌細胞隨機分為4組：正常對照組、ISO組、ISO+pFLAG組、ISO+14-3-3η組。流式細胞儀檢測H9c2心肌細胞凋亡；Western blot檢測H9c2心肌細胞中半胱氨酸蛋白酶（caspase）-3、caspase-12、葡萄糖調節蛋白78（GPR78）、CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白（CHOP）的表達情況；采用試劑盒檢測各組細胞丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）的活性。結果ISO刺激H9c2心肌細胞后，與正常對照組比較，ISO組細胞凋亡率顯著增高（P＜0.05），caspase-3與caspase-12的表達升高（P＜0.05），MDA含量增高（P＜0.05），SOD活性降低（P＜0.05），內質網應激反應標志蛋白GPR78與CHOP的表達顯著增高（P＜0.05）。轉染pFLAG-14-3-3η后再進行ISO處理，與ISO組比較，ISO+14-3-3η組心肌細胞的凋亡率顯著降低（P＜0.05），caspase-3與caspase-12的表達明顯減少（P＜0.05），MDA含量降低（P＜0.05），SOD活性增大（P＜0.05），GPR78與CHOP的表達顯著降低（P＜0.05）。結論14-3-3η可以通過抑制內質網應激反應減輕ISO誘導的H9c2心肌細胞損傷。

14-3-3η；內質網應激；心肌細胞

內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是機體在受到有害刺激時做出的自身保護性應答。研究表明，在細胞受到各種刺激的損害時，適宜的內質網應激對細胞有保護作用，而過長時間或過強的內質網應激會導致細胞的保護機制不能與損傷相抗衡，此時內質網穩態受到損害，使細胞凋亡[1]。內質網應激在腫瘤、糖尿病、神經性系統退行性疾病等多種疾病的發生發展中起重要作用[2]。心血管疾病是目前對人類健康威脅最大的疾病之一，近年來多項研究表明內質網應激參與了多種心血管疾病的發生發展[3]。心肌細胞凋亡是影響多種心血管疾病病理生理的重要機制之一[4-5]。最新研究發現，內質網應激參與心肌細胞凋亡的調節[6]，并且14-3-3η也參與小鼠心肌細胞的凋亡的調節[7]，同時14-3-3η對ERS誘發的細胞凋亡有抑制作用[8]。本研究通過建立異丙腎上腺素（isopro terenol，ISO）損傷H9c2心肌細胞模型，探討14-3-3η能否通過抑制內質網應激來保護心肌細胞損傷。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

載體pFLAG和LipofectamineTM-2000購自Invit rogen公司；限制性內切酶EcoRⅠ與KpnⅠ、ISO、EDTA、胰蛋白酶購自Sigma公司；胎牛血清、高糖DMEM培養基購自HyClone公司；大鼠H9c2心肌細胞購自美國模式培養物保藏所；山羊抗鼠14-3-3η、caspase-3、caspase-12、葡萄糖調節蛋白78（glucose regulated protein 78，GPR78）、CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白（CCAAT/enhancer binding protein homologous protein，CHOP）和β-actin一抗，HRP-標記的兔抗山羊二抗購自Pierce公司；AV/PI雙染凋亡檢測試劑盒購自BD公司。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（maleic dialdehyde，MDA）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 14-3-3η真核表達質粒pFLAG-14-3-3η的構建及轉染

設計14-3-3η的PCR擴增引物，并在引物兩端加入EcoRⅠ和KpnⅠ兩個限制酶切位點以及保護性堿基。提取心肌細胞H9c2的總RNA進行反轉錄，以反轉錄產物cDNA為PCR模板。PCR的反應條件為94℃5 min；94℃30 s，59℃30 s，72℃30 s，25個循環；最后在72℃下延伸10 min。用EcoRⅠ和KpnⅠ雙酶切PCR擴增產物以及pFLAG質粒，收集目的片段后進行連接、篩選、質粒提取，并進行雙酶切鑒定與測序鑒定。LipofectamineTM-2000與DNA以2.0∶0.8比例混合，轉染心肌細胞H9c2；轉染24 h后，Western blot檢測14-3-3η蛋白表達評測轉染效率。

1.3 心肌細胞培養與分組處理

心肌細胞H9c2用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養液，在37°C，5%CO2培養箱中培養，傳代后取對數期生長狀況良好的細胞進行試驗。細胞分為4組：正常對照組：未轉染質粒，未經ISO處理，在含5%胎牛血清的培養基中培養；ISO組：在對照組的基礎上加入終濃度為10 μmoL/L的ISO，進行6 h孵育；ISO+ pFLAG組：空載質粒pFLAG轉染至H9c2細胞，24 h后處理同ISO組；ISO+14-3-3η組：重組表達質粒pFLAG-14-3-3η轉染H9c2細胞24h后，處理同ISO組。

1.4 流式細胞法檢測心肌細胞凋亡

用4℃預冷的PBS將各組H9c2細胞洗滌2次，隨后加入0.25%胰酶（含0.0.2%EDTA）消化并收集細胞。加入1 mL Annexin V結合緩沖液，800 r/min離心5 min后棄上清，加入200 μL結合緩沖液重懸細胞。懸液中加入5 mg/L的Annexin V-FITC 10 μL PI 5 μL，混勻后37℃避光孵育30 min。最后以488 nm為激發波長，530 nm為發射波長，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.5 Western blot檢測蛋白表達

H9c2細胞被接種在35 mm培養皿內，分組處理后，加入65 μL RIPA細胞蛋白裂解液，提取細胞總蛋白，用BCA法進行蛋白定量。總蛋白經SDS-PAGE電泳分離后，進行電轉膜；5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，分別加入1∶3000稀釋的山羊抗鼠14-3-3η、caspase-3、caspase-12、GPR78、CHOP和β-actin一抗，4℃輕搖過夜；隨后加入1∶100比例稀釋的相應的HRP-標記的兔抗山羊二抗，室溫孵育1 h，漂洗3次；最后X線膠片曝光分析，結果用Image-Pro Plus處理，以待測蛋白與內參β-actin的灰度值比值作為蛋白的相對表達量。

1.6 SOD含量測定

SOD的活性檢測按照試劑盒使用說明完成。每組心肌細胞中加入酶工作液與水溶性四氮唑鹽（WST）工作液，37℃恒溫孵育20 min，540 nm波長處測量其吸光值。

1.7 MDA含量測定

MDA的含量，用酶聯法測定。按照MDA試劑盒說明測定各組H9c2心肌細胞中MDA的含量。收集細胞，加入20%三氯乙酸（TCA）孵育20 min，隨后加入0.1 mol/L鹽酸（HCl）和0.67%硫代巴比妥酸（TBA）于95℃水浴1 h。離心后在532 nm波長處測量其吸光值。

1.8 統計學方法

實驗數據采用統計學軟件SPSS13.0分析，正態分布計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數資料以率表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 pFLAG-14-3-3η轉染心肌細胞后14-3-3η蛋白表達顯著上調

Western blot結果顯示，H9c2細胞轉染pFLAG-14-3-3η后，14-3-3η蛋白表達顯著上調（P＜0.05），表明重組表達質粒成功轉染至H9c2細胞。見圖1。

2.2 pFLAG-14-3-3η轉染抑制ISO誘導的H9c2心肌細胞凋亡率升高

結果顯示：與正常組相比，H9c2心肌細胞經ISO處理后，細胞凋亡率顯著增加；當轉染pFLAG-14-3-3η質粒后，ISO誘導的心肌細胞凋亡受到明顯抑制。見圖2。

2.3 pFLAG-14-3-3η轉染抑制ISO引起的凋亡蛋白caspase-3、caspase-12表達變化

為了進一步明確14-3-3η對心肌細胞凋亡的抑制作用，采用Western blot方法檢測各組細胞中凋亡蛋白caspase-3與caspase-12的表達。結果表明：在ISO處理組中，caspase-3與caspase-12的表達顯著升高（P＜0.05）；而在pFLAG-14-3-3η質粒轉染組中caspase-3與caspase-12的表達顯著下調（P＜0.05）。見圖3。

2.4 pFLAG-14-3-3η轉染抑制ISO誘發的細胞內MDA、SDO水平變化

結果顯示：H9c2心肌細胞經ISO處理后MDA的含量顯著增加（P＜0.05），SOD活性顯著降低（P＜0.05）。在ISO處理前轉染pFLAG-14-3-3η質粒24 h，可明顯降低ISO引起的MDA含量增加（P＜0.05），并顯著提高SOD的活性（P＜0.05）。見圖4。

2.5 pFLAG-14-3-3η轉染抑制ISO誘導的內質網應激蛋白GRP78及CHOP的表達

結果表明：GPR78和CHOP的表達在ISO處理組中顯著升高（P＜0.05），并在pFLAG-14-3-3η質粒轉染組中明顯降低（P＜0.05）。見圖5。

3 討論

近年來，心肌細胞凋亡一直是心血管領域的研究熱點。14-3-3η是屬于14-3-3蛋白家族其中一個亞型[9]。14-3-3蛋白家族是一類酸性二聚體可溶性蛋白，具有高度保守性，可與包括核轉錄因子在內的多種蛋白相互作用影響細胞功能，甚至可以與激酶、受體等蛋白結合，在信號轉導、細胞生長、分裂、分化、凋亡、細胞周期等眾多生理過程中發揮重要作用[10-11]。研究發現，14-3-3蛋白影響多種心血管疾病的病理進程[12]。近年來在細胞水平上對心肌細胞損傷與保護的研究已成為國內外心血管疾病研究發展的新方向。其最大的優點在于可以精確反映特定的因子對心肌細胞損傷的保護作用。β1腎上腺素受體是心臟功能調節的主要受體，ISO是該受體的激動劑，臨床上主要用于房室傳導阻滯、心臟休克、驟停等心血管疾病的治療。目前常用ISO來建立缺血性心臟病以及心力衰竭的動物模型[13-15]。研究發現用ISO誘導大鼠心肌損傷，會引起心肌細胞的內質網應激反應，從而導致心肌細胞凋亡[16]。據此，用ISO建立心肌細胞損傷模型，轉染含有14-3-3η的表達載體pFLAG-14-3-3η至心肌細胞H9c2中，通過研究該表達載體的轉染對細胞凋亡，細胞損傷程度以及內質網應激標志蛋白的表達的影響，探討14-3-3η對ISO誘導心肌細胞損傷的保護作用及其機制。

本研究首先檢測轉染了pFLAG-14-3-3η的H9c2心肌細胞中的14-3-3η的表達，發現與正常對照組相比，轉染重組質粒的心肌細胞中14-3-3η的表達明顯增高（P＜0.05），說明重組表達質粒能在心肌細胞中有效表達。通過流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，結果顯示，ISO組中的細胞凋亡率顯著增高（P＜0.05），ISO+pFLAG-14-3-3η組的細胞凋亡率與ISO組相比顯著降低（P＜0.05），提示14-3-3η對ISO誘導的細胞凋亡具有抑制作用，這一結果與國外學者觀察到的結果相同[7]。本研究通過檢測心肌細胞中凋亡蛋白caspase-3與caspase-12的表達，發現凋亡蛋白在ISO組中表達升高（P＜0.05），且在pFLAG-14-3-3η轉染組中降低（P＜0.05），進一步證明了14-3-3η對細胞凋亡的保護作用。

本研究用MDA含量與SOD活性來衡量心肌細胞受損傷的程度，結果顯示14-3-3η可減少有ISO引起的MDA含量升高（P＜0.05），并提高ISO引起SOD活性降低（P＜0.05），說明14-3-3η對ISO的細胞毒性有逆轉作用，對ISO引起的細胞損傷有保護作用。已有研究證明14-3-3η對細胞凋亡的調控作用與ERS密切相關[8]。為進一步研究14-3-3η對心肌細胞損傷的保護機制，本研究檢測了內質網應激標志蛋白的表達。GRP78又稱免疫球結合蛋白，是公認的內質網應激信號系統的上游開關分子，是ERS的關鍵調節蛋白[17]。CHOP是ERS誘導的細胞凋亡的關鍵調節分子。正常細胞中CHOP的表達非常低，而在細胞受到刺激產生內質網應激反應時，其表達顯著增加[18]。本研究結果發現，GRP78與CHOP的表達在ISO組中顯著升高（P＜0.05），說明ISO可誘導心肌細胞H9c2產生內質網應激，與相關研究結果一致[16]。在ISO+ pFLAG-14-3-3η組中，GRP78與CHOP的表達與ISO相較明顯降低（P＜0.05），表明14-3-3η能夠抑制ISO激活的心肌細胞中的內質網應激反應。

綜上所述，本研究結果證實了ISO會引起心肌細胞內質網應激反應從而誘導心肌細胞損傷，而轉染重組表達質粒pFLAG-14-3-3η可以通過減輕細胞中內質網應激來降低心肌細胞損傷程度，說明14-3-3η可通過抑制內質網應激保護ISO誘導的心肌細胞損傷。

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Protection of 14-3-3η to H9c2 cardiomyocytes injury through inhibiting endoplasmic reticulum stress reaction

WANG Anxing1MA Wangge2CHEN Fangyuan2HUANG Xin2ZHOU Juan2Guo Ning2▲
1.Second Department of Cardiovascular,Chinese Medicine Hospital of Baoji City,Shaanxi Province,Baoji721001, China;2.Department of Vasculocardiology,the First Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University,Shaanxi Province, Xi'an710061,China

ObjectiveTo study the effectof 14-3-3η on isoprenaline(ISO)induced H9c2 cardiomyocytes injury through inhibiting endoplasmic reticulum stress.MethodsThe recombinant expression vector pFLAG-14-3-3η was constructed and transfected into H9c2 cells.The cardiomyocytes injury model was established by using ISO.The H9c2 cells were randomly divided into four groups:control group,ISO group,ISO+pFLAG group,ISO+14-3-3η group.Cell apoptosis was detected by flow cytometry.Protein expression levels ofcaspase-3,caspase-12,glucose regulated protein 78(GPR78),and CCAAT/enhancer binding protein homologous protein(CHOP)were examined by western blot.Themaleic dialdehyde(MDA)content and superoxide dismutase(SOD)activity was measured by the MDA and SOD detection kit,respectively.ResultsAfter ISO stimulating H9c2 cardiomyocytes,compared with the control group,in ISO group,the cell apoptosis increased(P＜0.05),the expression levels of caspase-3 and caspase-12 increased(P＜0.05), the content of MDA increased(P＜0.05),the activity of SOD decreased(P＜0.05),and the expression levels of GRP78 and CHOP increased(P＜0.05).After reversed by pFLAG-14-3-3η transfection,dealed with ISO,compared with ISO group,in ISO+14-3-3η group,the expression levels of caspase-3 and caspase-12 decreased(P＜0.05),the content of MDA decreased(P＜0.05),the activity of SOD increased(P＜0.05),and the expression levels of GRP78 and CHOP decreased(P＜0.05).ConclusionThe 14-3-3η over expression protects cardiomyocytes against ISO-induced cell injury via inhibiting endoplasmic reticulum stress.

14-3-3η;Endoplasmic reticulum stress;Cardiomyocytes

R542.2

A

1673-7210（2015）04（b）-0022-05

2015-01-04本文編輯：蘇暢）

▲通訊作者