水貂沙門氏菌的分離鑒定與藥敏試驗

王海龍 秦國棟（山東省諸城市積溝畜牧獸醫站 262200）張敏敏（山東農業大學 271000）

水貂沙門氏菌的分離鑒定與藥敏試驗

王海龍 秦國棟（山東省諸城市積溝畜牧獸醫站 262200）張敏敏（山東農業大學 271000）

目前，規模化養貂場一般采用抗生素治療水貂沙門氏菌病。但是由于抗生素的濫用以及不當的服用，導致細菌耐藥性的產生，造成用藥浪費，延誤水貂病情，使養殖戶遭受巨大的經濟損失。本試驗通過藥物敏感性試驗，為選用有效抗生素提供依據。

1 試驗材料與儀器

1.1 試驗材料

1.1.1 病料來源

60只病死水貂樣本均來源于諸城市大森林養殖基地。臨床主要表現病初水貂不進食，情緒也不穩定，體溫增加，一般為41～42℃，并伴有呼吸困難；部分水貂伴有嘔吐和腹瀉，或者輕微的黃疸癥狀。大部分水貂出現上述癥狀一段時間內就死亡。也有的水貂出現持續性腹瀉，糞便帶有血液；有的患貂出現化膿性結膜炎；咳嗽或嘔吐。有的水貂發出痛苦的叫聲，突然就昏迷抽搐，四肢做游泳狀滑動。發病的水貂出現水腫癥狀。個別的貂沒有癥狀突然死亡。尸體消瘦，可視膜蒼白；肺臟萎縮、表面有黑色壞死斑，嚴重出血；心代償性增大；肝臟輕微腫大，表面有針尖大小出血點；胃干癟，粘膜脫落；腸系膜毛細血管充血；腸粘膜出血、脫落；脾臟輕微腫大，被膜緊張；腎臟稍微腫大，呈灰紅黃色被膜下有點狀出血。

1.1.2 培養基及試劑

顯色培養基 （購自青島海博生物公司； 批號：20130301）、膽鹽硫乳瓊脂培養基（DHL）（購自上海一基生物科技有限公司；批號：20130311）、沙門菌屬志賀菌屬瓊脂 （SS）（購自北京九州天瑞科技有限公司； 批號：20130312）、三糖鐵瓊脂 (TSI）（購自上海科興生物科技有限司；批號：20130115）、生化常規微量鑒定管（購自上海麗臣生物科技有限公司；批號：20130119）等。

1.1.3 藥敏試驗紙片

由諸城市畜牧獸醫管理局實驗室制作。

1.2 試驗儀器

HT-SDC(SW-CJ-2F）超潔凈工作臺（濟南昊天科技發展有限公司）、MLS-3780高壓滅菌鍋（杭州亞旭生物科技有限公司）、DHP-9602恒溫培養（杭州匯爾儀器設備有限公司）、冰箱、常用玻璃器皿等。

2 試驗方法

2.1 病原菌分離鑒定

2.1.1 各種培養基的制備

顯色培養基、膽鹽硫乳瓊脂、三糖鐵瓊脂、按常規進行配制，無菌檢查后，4℃保存備用[1]。

2.1.2 涂片及染色

取采集的肺臟、肝臟、脾臟和腎臟病料刮取物涂片，干燥，革蘭氏染色。將抹片置于空氣中自然干燥；火焰固定，將已干燥的抹片菌膜向上，在火焰上緩緩來回通過3次（用手背觸及玻片反面，以不燙手為宜）。染色：①初染，在固定的抹片上，滴加草酸銨結晶紫染色液染色1～2min，水洗。②媒染，再加革蘭氏碘溶液于抺片上，助染1～2min，水洗。③脫色，用95%酒精滴于載玻片上脫色約30s。應將載玻片不時搖動，至無色素脫下為止，水洗。④復染，用沙黃染液復染1min，水洗。⑤吸干或自然干燥。鏡檢觀察[2]。

2.1.3 分離培養與觀察

取采集的肺臟、肝臟、脾臟和腎臟病料刮取物，接種于顯色培養基、膽鹽硫乳瓊脂平板和SS營養瓊脂平板，37℃培養24h，觀察細菌生長情況及菌落特征；同時，將上述內臟組織樣本勻漿后制成懸液，將組織懸液樣本及上述血樣本分別接種于普通瓊脂平板37℃常規24h。待培養完畢后，再分離單獨菌落得到純培養物。挑選可疑的單菌落劃線接種于營養瓊脂培養基上，37℃恒溫培養24h，觀察細菌生長情況及菌落特征，然后單個菌落抹片，進行革蘭氏染色、顯微鏡觀察。從鑒別培養基上挑取2～3個疑似菌落接種于三糖鐵瓊脂斜面并刺穿至底層，在恒溫培養箱培養18～24h，觀察結果。

2.1.4 生化試驗

用接種環從營養瓊脂培養基中挑選出具有代表性的菌落與微量發酵管中，置37℃培養12h觀察其生長情況。甲基紅（MR試驗）：用接種環從營養瓊脂培養基中挑選出具有代表性的菌落，接種到葡萄糖蛋白胨培養管中培養36～48h，加入MR試劑5滴左右，觀察其變化。靛基質試驗：用接種環從營養瓊脂培養基中挑選出具有代表性的菌落，接種到蛋白胨水培養基中培養24～48h，試管中加入靛基質數滴搖動試管，觀察其變化情況。硫化氫產生試驗：用接種環取少量培養物，接種到培養基中培養24～48h，觀察其變化。V-P試驗：取一支葡萄糖蛋白胨培養管先加V-P試劑甲液（6%的甲萘酚酒精溶液）3ml，再加V-P乙液（40%KOH溶液），充分搖勻靜止數分鐘，觀察其變化情況。

2.2 藥敏試驗

采用紙片擴散法進行藥敏試驗，將細菌均勻涂布在營養瓊脂平板上，再將配制好的藥敏片貼于平板上，放在37℃恒溫箱中培養24h后，測量兩個平板上的抑菌圈直徑，取其平均值，結果判斷判定標準：抑菌直徑＜10mm為耐藥；抑菌直徑10～15mm為中度敏感；抑菌直徑15～20mm為高敏；抑菌直徑≥20mm為極敏。

3 試驗結果及分析

3.1 涂片染色結果

革蘭氏染色之后，在油鏡下觀察可見大量兩端鈍圓、短小的革蘭氏陰性小桿菌，無芽孢，無莢膜。

3.2 分離培養結果

在顯色培養基上呈紫色；而SS瓊脂平板上呈圓形、微凸、邊緣整齊小菌落，菌落為白色半透明；另外在DHL瓊脂平板上呈圓形、微凸、邊緣整齊黑色的小菌落。分離菌株在三糖鐵瓊脂斜面中產酸、斜面變紅。

3.3 生化試驗結果

該菌能分解葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、山梨醇，不分解乳糖、蔗糖，靛基質試驗呈陰性，MR試驗陽性，V-P試驗陰性，不分解尿素，能利用枸櫞酸鈉。

3.4 藥敏試驗結果

該沙門氏菌對環丙沙星、左旋氧氟沙星、克林霉素、頭孢曲松鈉為高敏，對萬古霉素、硫酸粘菌素為中敏，對丁胺卡那霉素、氨芐西林、慶大霉素為低敏。

根據流行病學、病理剖檢變化及實驗室診斷，可判斷該次疾病的流行是由沙門氏桿菌感染引起。根據藥敏試驗結果，用0.5%鹽酸左旋氧氟沙星全群飲水治療，不能飲水的病貂肌肉注射頭孢曲松，經3天的治療，病情得到有效的控制。

4 討論

（1）根據水貂的臨床癥狀、病理剖檢、細菌的分離鑒定和生化試驗、判定水貂患病死亡是由于感染了沙門氏菌引起。

（2）由黃世娟等[3]人研究的雞沙門氏菌藥敏試驗分離菌對壯觀霉素、卡那霉素、四環素高敏；對青霉素、利福平中敏；對環丙沙星、恩諾沙星、林可霉素低敏；對萬古霉素、鏈霉素產生耐藥。由劉俊偉等[4]人研究的豬霍亂沙門氏菌對18種抗菌藥的敏感性試驗豬霍亂沙門氏菌對左旋氧氟沙星、磷霉素鈉、頭孢噻呋敏感，對諾氟沙星和新霉素中敏，對頭孢唑啉、頭孢拉定、利福平、環丙沙星、卡那霉素、氨芐西林、慶大霉素、阿莫西林、恩諾沙星等耐藥。在趙波等[5]的研究中，其所分離多株沙門氏菌均表現出不同耐藥性，而其中羧芐西林的耐藥率最高。而本次藥敏試驗結果與上述結果有一定的出入，這可能與不同養殖場用藥習慣有關。

（3）通過多次對諸城大森林養殖基地調查研究，養殖場備有大量的丁胺卡那霉素、氨芐西林、慶大霉素。養殖場人員在水貂發病時，并沒有做藥物敏感試驗而盲目的濫投藥，致使本次試驗中對丁胺卡那霉素、氨芐西林、慶大霉素低敏，正是因為養殖場用藥習慣使沙門氏菌產生耐藥的結果。

（4）通過多次試驗采取對癥治療辦法具有一定的輔助治療作用，對體溫過高的水貂直腸給藥清瘟敗毒散；對腹瀉不止的可用烏梅散開水沖調，候溫灌服；對水腫的病貂可將五苓散伴水飼喂具有較好的治療效果。

[1]胡桂學.獸醫微生物學實驗教程[M].北京:中國農業大學出版社,2006（9）:22-28.

[2]黃世娟,陳進喜,彭定兵,等.雞沙門氏菌的分離鑒定及藥敏試驗[J].廣西畜牧獸醫,2011,27（4）:213-215.

[3]楊曉潔.梅花鹿單核細胞增生性李氏桿菌病的診治[J].畜牧與獸醫,2007,39（7）:48.

[4]俊偉,張海棠,張志鵬,等.規模化豬場豬霍亂沙門氏菌的分離鑒定與藥敏試驗[J].河南農業科學,2011,40（4）:146-148.

[5]趙波,李波,王強,等.靈長類動物腸道沙門氏菌的分離鑒定與藥敏試驗[J].中國畜牧獸醫,2013,40（1）:164-167.

王海龍（1963-），男，獸醫師，專科。

張敏敏（1989-），女，碩士研究生。