李斯特菌生物學特征與臨床相關性

焦 穎，張 巍

產單核 細胞李 斯特菌（Listeria monocytogenes），是一種環境致病菌，可以引起李斯特菌病；通常是人們食用了被這種菌污染的食物而引起的［1］。根據美國疾病控制中心（CDC）報道2011年美國暴發因食用甜瓜而引起的李斯特菌感染，147例中有33例死亡，1例孕婦流產。與普通人相比，孕期婦女是高度危險人群，一旦感染了李斯特菌可能會導致自然流產或早產，其新生兒可能發生血流感染及腦膜炎［2-3］。李斯特菌感染危險對象還包括免疫力低下人群，年齡65～70歲人群也是感染高發人群。李斯特菌病有多種臨床表現形式，感染患者病死率很高。李斯特菌病在歐美等發達國家常有報道，美國每年大約有2 500例因感染產單核細胞李斯特菌繼發嚴重的疾病，大約有500例死亡［4］，但在發展中國家尚未引起廣泛關注。本文主要目的是了解國內外關于李斯特菌生物學特征的研究及與臨床的相關性。

1 李斯特菌生物學特性及流行病學特點

產單核細胞李斯特菌屬于李斯特菌屬，為細胞內寄生的革蘭陽性無芽孢桿菌。產單核細胞李斯特菌是重要的人獸共患病病原體，為其菌屬中唯一人類致病菌，可通過食用被污染的食物在人畜間傳播，1%～5%正常人及10%～20%屠宰場工作人員為無癥狀帶菌者，成為主要傳染源［5］?？芍氯祟惖哪X膜炎、血流感染、肺炎、急性胃腸炎、流產等疾病。

產單核細胞李斯特菌為需氧或兼性厭氧，感染后患者病死率高達30%［6］。該菌對各種應激（低溫、高鹽、低pH、氧化應激等）條件有很強的耐受性，進一步增大了該菌的危害性［7］。此菌不產生內毒素，可產生一種溶血性外毒素，對人類致病性強［8］。同時也是食品中常見的、公共衛生學上重要的食源性病原菌。WHO 和FDA 于1986 年設立了李斯特菌研究中心，專門協調該菌的病原學、流行病學及臨床等研究工作［9］。該菌已被列為20世紀90年代四大食源性疾病致病菌之一［10］。產單核細胞李斯特菌廣泛分布在自然環境中，如土壤、污水、飼料、動物、健康人及各種生食和即食食品中，包括生肉及熟肉制品、速凍米面食品、奶酪、蔬菜、沙拉和海產品等，目前至少42 種動物22 種禽類已帶菌。近10余年來世界各地，特別是美國、法國、英國、西班牙和日本等發達國家因產單核細胞李斯特菌污染食品而引起食源性疾病暴發日益增多［11］。我國到目前為止，雖未出現有關產單核細胞李斯特菌引起食物中毒暴發流行的報道，但從國內多篇調查報道了解，此菌多年來在我國豬、羊、雞、牛、兔等家禽家畜中有流行，并已經報告的臨床散發病例有數十例。目前由產單核細胞李斯特菌污染引起的食品中毒已受到世界各國的重視［12］。

高溫烹飪食物可殺滅李斯特菌，但隨著飲食習慣逐漸變化，食用生冷及半熟食的人群增多，致使李斯特菌感染率增高。感染后主要臨床表現為發熱、上呼吸道感染、肺炎、腹瀉、血流感染、腦膜炎，甚至死亡。

2 李斯特菌的分型方法及流行病學特點

李斯特菌屬現在有6個種，分別是產單核細胞李斯特菌，英諾克李斯特菌，伊氏、格氏、莫氏、塞氏李斯特菌。其中伊氏李斯特菌又包括伊氏亞種和倫氏亞種；格氏李斯特菌包括格氏亞種和默氏亞種。目前，利用不同的培養基可以從菌落形態及顏色上來區分產單核細胞李斯特菌與其他李斯特菌，從而達到對前者進行快速的定性鑒定和定量計數；采用聚合酶鏈反應（PCR）和脈沖場凝膠電泳（PFGE）方法可對其進行獨立基因檢測及分子學分型［13-14］。

2.1 血清分型

血清分型是很多食源性微生物如沙門菌、產單核細胞李斯特菌等的經典分型方法。該種方法已被應用于流行病學調查。該法通過采用血清凝集試驗，O 抗原采用玻片凝集法，鞭毛H 抗原采用試管凝集法，可將產單核細胞李斯特菌分為16 個血清型：1／2a、1／2b、1／2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、4d、4e、5、6a、6b和7。抗原結構與毒力無關，對人致病的主要為血清型4b，其次是1／2a 和1／2b，三者約占本病的90%；從食品中分離得到的血清型主要為1／2a（54.72%），1／2b（20.75%）和1／2c（18.87%），4b 血清型相對較少［15］。這幾種血清型均有較強的致病性，能引起嚴重的李斯特菌食源性疾病，危害身體健康。因此，應加強相關食品中產單核細胞李斯特菌的監測力度，重點防治由上述幾種血清型菌株引起的食物中毒［16］。

對從食品中分離出的產單核細胞李斯特菌進行分子學特征和潛在毒性研究，結果顯示，從食品中分離的88 株該菌中，42株血清型為1／2a或3a，23 株血清型為1／2b或3b，15 株血清型為1／2c或3c，6株血清型為4b、4d或4e，2株血清型為4a或4c。臨床李斯特菌病的患者中4b血清型占一半，但其在食品中的比例相對較低，這提示4b血清型可能在諸如宿主胃中這種不利條件下，耐受力更強或比1／2a、1／2b、1／2c型更易進入宿主細胞［17］。

2.2 分子分型

PFGE如今已經廣泛用于產單核細胞李斯特菌的分子流行病學和溯源性追蹤研究，是目前所有分型方法中最為可靠的一種。由于其分辨能力強、重復性好，成為分子分型方法的金標準［18］。通過細胞的裂解，菌體膠塊的制備及膠塊內DNA 酶切等過程，利用PFGE 指紋圖譜獲得的李斯特菌的分子特征，可以從2 個途徑幫助流行病學調查：一是與暴發相關的地域和目前散在事件的相關性，二是流行病學專家把PFGE圖譜應用于病例-對照研究中，以指導鑒定與食品相關的暴發事件。PFGE 可以將相同血清型的菌株分為不同帶型，說明PFGE 分型法比血清學分型法分辨力更高。PFGE 分型結果顯示，有5種主要的PFGE 基因型，Q 型（22.64%）；P型（15.09%）；L 型；J 型（11.32%）和H 基 因型［19］。

2.3 分子亞分型

傳統的產單核細胞李斯特菌分型方法有血清分型、噬菌體分型及多區帶酶電泳（MEE）等。血清分型對于產單核細胞李斯特菌亞型的區分和流行病學調查相對不太靈敏。噬菌體分型雖然速度較快，但需要一套標準化的參考噬菌體以使不同實驗室之間的結果具有可比性。噬菌體分型的標準化也是一個挑戰，因為這種方法本身就受到生物學變異和實驗變異的影響。MEE 與分子亞分型相比辨別能力較弱。Wiedmann等［20］利用核糖體分型（riboty ping）和對hly 基因以及actA 基因進行測序將產單核細胞李斯特菌分為3個譜系（lineage）。研究還表明，譜系Ⅰ主要是人類分離株和暴發流行分離株，這個譜系包含1／2b、3b、4ab、4b、4d、4e和7血清型的菌株。譜系Ⅱ的大部分菌株屬于食品分離株，包括1／2a、1／2c、3a和3c血清型。在美國60%食品分離株屬于譜系Ⅱ，只有40%人群分離株和15%暴發流行株屬于譜系Ⅱ。譜系Ⅲ的菌株在人群臨床分離株中極為罕見，大約有15%動物分離株屬于該譜系。譜系Ⅲ的菌株血清型大多為4a和4c。有研究表明產單核細胞李斯特菌譜系Ⅲ的菌株對人的致病力降低，這預示著譜系Ⅲ能在進化過程中獨立于譜系Ⅰ和譜系Ⅱ之外的分支。但利用隨機擴增多態性DNA（RAPD）和限制性片段長度多態性（RFLP）分型發現，130株產單核細胞李斯特菌分為2個譜系。因此，譜系Ⅲ在進化樹上的位置還需進一步探討。研究發現的這2個譜系菌株間的同源性為85%左右，說明這2個譜系是產單核細胞李斯特菌進化過程中的不同分支。同一譜系內的產單核細胞李斯特菌菌株同緣性較高［21］。

目前，國外產單核細胞李斯特菌分子鑒定與分子亞分型技術已初步建立，但國內類似的工作開展較少。分子亞分型是一種能快速鑒定產單核細胞李斯特菌的方法，通過建立一套以DNA 序列為基礎的分子亞分型體系，可以快速確定食品的污染來源，并為進一步研究產單核細胞李斯特菌群體遺傳學、流行病學及生態學奠定良好的技術基礎［22］。

臨床上結合以上分型方法可確定菌株是否為同一克隆，如新生兒李斯特菌感染時是否因為母親感染李斯特菌后通過胎盤垂直傳播所致；同時李斯特菌感染流行時，結合以上分型方法確定是否為食源性或水源性，若同一地區所有發病患者分泌物培養出的李斯特菌與食物或水中檢出的李斯特菌為同一克隆時，則可說明此地區李斯特菌感染流行為被污染食物或飲用水導致。

血清型和PFGE2種分型方法相互不能替代，兩者從不同側面反映產單核細胞李斯特菌的分型特點。結合2種分型方法能更好地了解產單核細胞李斯特菌各菌株之間的遺傳相關性及流行病學特征，促進了對李斯特菌病流行的監控和產單核細胞李斯特菌污染源的追蹤［23］。鑒于PFGE 分型結果與血清學分型結果密切相關，且前者比后者分辨力高，而后者比前者操作簡便穩定。故建議在工作中，先對菌株進行血清學分型，有相同或相近分型結果的菌株才進一步做PFGE分型［24］。

3 李斯特菌毒力因子及其致病性

李斯特菌主要毒力因子為一個具有成孔蛋白特性的李斯特菌溶血素LLO、肌動蛋白聚合蛋白和一個依賴鋅的金屬蛋白酶。LLO 是產單核細胞李斯特菌的重要毒力因子，由hly 基因編碼。其相對分子質量為60 000，屬于膽固醇依賴細胞溶素家族，參與產單核細胞李斯特菌一級和次級吞噬小體的逃離［25］。產單核細胞李斯特菌的致病性與LLO 密切相關，具有LLO 的產單核細胞李斯特菌有致病性，無LLO 則無致病性［26］。actA 與產單核細胞李斯特菌基于肌動蛋白的運動性有關，有研究表明，actA也參與產單核細胞李斯特菌的細胞黏附和侵襲。actA 缺失突變株因改變了硫酸乙酞肝素的識別功能，對鼠巨噬細胞IC-21和中國蒼鼠卵巢上皮細胞的黏附和侵襲力顯著降低。另外，無害李斯特菌中actA 的表達可促進該細菌入侵到上皮細胞系中［27-28］。產單核細胞李斯特菌黏附與侵入宿主細胞的過程與內化素A、B（inlAB）有關，而其在細胞內增殖及細胞間擴散能力則由毒力基因plcA、hly、mpl、actA、plcB 介導。PrfA（prfA）調控這些毒力因子，與plcA、hly、mpl、actA、plcB 構成第一毒力島（LIPI-1）［29］。產單核細胞李斯特菌正常菌株感染細胞后，能裂解吞噬泡膜，使細菌進入到宿主細胞胞質中，而缺乏LLO 的突變體感染上皮細胞后滯留在吞噬泡內。近年的研究表明LLO 是一個多功能的毒力因子，能引起宿主細胞諸多反應，如細胞增殖、黏膜細胞外滲作用、巨噬細胞中細胞因子的表達、樹突狀細胞的凋亡、磷脂代謝及引起機體產生免疫反應等［30］。產單核細胞李斯特菌能產生2 種磷脂酶C：磷脂酰肌磷脂酶C（PI-PLC）和寬范圍的磷脂酶C（PC-PLC）。plcA 基因編碼一個特異的作用于PI-PLC。plcB 基因編碼一個PC-PLC。目前的研究認為，PI-PLC毒性相對較小，對細菌在細胞間擴散作用不大，主要是協同PC-PLC 發揮作用。而PC-PLC的功能則較復雜，它使細菌從吞噬泡中逃逸出來，能破壞宿主細胞的信號通路，能調節細胞因子和化學因子的合成，還能通過二?；视?、神經酰胺、肌醇磷酸鹽等調節細胞的生長、分化、凋亡等。prfA 編碼PrfA 蛋白，是產單核細胞李斯特菌毒力基因簇上各種毒力基因的調節蛋白，直接檢測prfA 可以減少其他毒力基因突變或缺失所造成假陰性結果的概率。從實驗結果可以看出，帶有hly、plcA、plcB 和prfA 毒力相關基因的產單核細胞李斯特菌均屬于致病株［31］。

人類感染李斯特菌后，臨床癥狀及預后差異較大，部分患者感染后只是帶菌狀態，而不發病，而有的患者感染后則合并血流感染、腦膜炎、甚至死亡。通過對毒力因子的檢測，可以在病原學角度對此病作出一定程度的解釋，病情的輕重除與機體免疫力有關外，與致病菌株毒力強弱、第一毒力島是否全部陽性及菌株逃逸均有一定程度的關聯。并且可在一定程度上主導臨床抗菌藥物治療力度及療程。

4 李斯特菌致病的免疫學機制

李斯特菌通過其各種毒力因子可在環境和食品中生存并繁殖，并可穿越胃腸道防御系統，跨越上皮細胞屏障，侵襲免疫系統細胞，并可全身擴散，甚至可穿越血腦屏障和胎盤屏障。同時作為侵襲性胞內菌，產單核細胞李斯特菌可逃離宿主吞噬小體，在細胞質中增殖，并將抗原呈遞給MHC-I類分子途徑，促進抗原特異保護性CD8＋T 細胞的生成。而且產單核細胞李斯特菌感染宿主的專職性抗原遞呈細胞（APC）后，可誘導有效的細胞免疫應答和Th1細胞因子的分泌［32］。細菌被先天免疫細胞如巨噬細胞內吞后，細胞壁成分刺激巨噬細胞分泌激活NK 細胞的白介素（IL）-12，腫瘤壞死因子（TNF）-α和激活中性粒細胞和IL-1。激活的NK 細胞又可刺激干擾素（IFN）-γ的產生，而IFN-γ可促進Tho大量生成，同時也可作用于巨噬細胞，上調其抗原加工過程，刺激IL-12 的分泌，并結合IFN-γ 激活Tho細胞為Th1 細胞，Thl細胞又可分泌IL-12、TNF 和IFN-γ。巨噬細胞激發一系列細胞因子分泌，最終也激活了先天性和獲得性細胞免疫應答［33］。與感染易感性增加有關的一個重要細胞因子就是IL-10。有研究顯示，IL-10 產量增多可提高李斯特菌感染易感性；一旦炎性反應被控制，IL-10對減緩炎性反應有重要意義。由不同數量的T 淋巴細胞、B 淋巴細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞產生的IL-10，其最重要的作用是抑制免疫系統的多種免疫細胞產生細胞因子。近年的一些研究顯示，給予李斯特菌感染的小鼠IL-10 則會提高小鼠的易感性，若給予抗IL-10受體抗體的小鼠則對李斯特菌感染有持續的抵抗力。李斯特菌感染時IL-10 主要由CD4＋CD25＋T淋巴細胞［34］、CD4＋CD25＋Foxp3＋T 淋巴細胞和巨噬細胞產生，與此同時巨噬細胞也產生IFN 和TNF，這2種細胞因子是感染時機體保護性免疫反應的重要細胞因子，會在感染時被IL-10 負調節。胞外菌的免疫應答主要由產生中和抗體的B 淋巴細胞介導，而胞內菌的免疫應答則由識別專職性APC細胞表面MHC 分子中抗原的T 淋巴細胞介導。T 淋巴細胞由不同的亞群組成，包括識別吞噬體內抗原的CD4＋T 淋巴細胞和識別細胞質中抗原的CD8＋T 淋巴細胞。產單核細胞李斯特菌感染可引發以上2種不同的免疫應答。產單核細胞李斯特菌是一種兼性細胞內增值的細菌，它的增值受到CD8＋、CD4＋T 淋巴細胞和分泌性IFN 等免疫調節細胞的影響［35］。

當機體感染大量細菌時，這些免疫機制可能會被阻斷，或者沒有能力去有效控制感染的進展。這種情況可能是由于細胞因子產生不足，及大量細菌毒素可以產生抑制性機制而致保護性免疫的下行性調節。感染早期，巨噬細胞產生多種細胞因子，包括IL-12、IL-10。在鼠類感染李斯特菌的研究中，IL-10在保護性免疫反應中起到抑制性作用，其機制如前所述。因此，這在一定程度上可以解釋高劑量感染李斯特菌小鼠致死的原因。

有研究顯示，給感染李斯特菌的小鼠注射抗IL-10特異性抗體可以短暫的減少細菌的負荷量，并且IL-10缺乏的小鼠對感染有更強的抵抗力［36］。另有研究顯示，在給新生小鼠注入產單核細胞李斯特菌前18 h預防性的腹腔內注射重組血清淀粉酶A（SAA）可以很大程度的減少李斯特菌的繁殖，激活巨噬細胞，并且不影響新生鼠的生長。PCR 技術顯示成年鼠在感染急性期時TNF、SAA1、SAA2表達均明顯高于新生小鼠，提示新生小鼠感染產單核細胞李斯特菌急性期時預防性注射SAA 可以很大程度激活免疫應答并減少細菌繁殖［37］。

但目前無論是抗IL-10抗體還是SAA 均尚未用于人類治療李斯特菌感染，目前國外大量研究尚停留在動物實驗階段。

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